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周期素依赖性蛋白激酶抑制剂3'单肟靛玉红对Alzheimer病治疗的实验研究

许利刚

   阿尔茨海默病(Alzheimet s disease, AD)是老年期痴呆的最常见的类型,其临床特点包括记忆力障碍、认知功能损害及行为异常。AD的发病率随着年龄的增加而上升。AD给家庭和社会带来沉重的负担,已经成为一个严重的社会和医疗问题。但是到目前为止,AD的发病机制尚不完全清楚,临床缺乏理想的治疗药物。因此,研究AD的发病机制及研发有效的防治药物显得尤为重要。 AD病理上以大脑出现细胞外老年斑(senile plaques, SP)、细胞内神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFTs)和神经元及突触减少为特征,特定区域神经元的丧失不仅是脑萎缩的形态学基础,还是引起患者临床学习和记忆障碍的关键。越来越多的证据显示,AD发病过程中周期素依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent kinases, Cdks)的异常激活可以导致细胞周期紊乱,诱发神经细胞死亡。 Cdks抑制剂最早用于癌症的治疗,最近已经有利用Cdks抑制剂作为神经保护剂的研究报道,但是大部分资料来自体外细胞培养实验,仅有少数研究来自神经变性和凋亡动物模型。虽然Cdks抑制剂治疗AD的可能机制尚不完全清楚,但是Cdks抑制剂已经用于研究异常的Cdks活性与神经变性性疾病的关系。Cdks抑制剂极可能成为治疗AD的重要靶标。 靛玉红(indirubin)是中国医学家们在传统中成药当归芦荟丸中发现抗肿瘤有效成分。目前已经清楚靛玉红是一种选择性的Cdks抑制剂,它可以在纳摩尔水平抑制Cdk1、Cdk2、Cdk5的活性,但其水溶性和脂溶性都很差,且有一定的肝毒性。然而,靛玉红的衍生物:3’单肟靛玉红(Indirubin-3’-monoxime, IMX),不仅是强有力的Cdks抑制剂,而且毒性低、分子量小、有较好的膜通透性,IMX可以与ATP竞争Cdks激酶的催化位点。本文工作旨在研究Cdks在Aβ_(1-40)诱导的AD动物模型中表达情况,并在此基础上研究Cdks抑制剂IMX对AD动物模型的实验性治疗作用。本实验不仅为AD的治疗探索新的途径和寻找有效的新药物,也为把IMX研发成临床新药积累实验基础。本文包括以下三部分工作: 第一部分Cdk4和cyclin B1在AD动物模型中的表达分析 目的:研究周期素依赖性蛋白激酶和周期素在Aβ_(1-40)诱导的AD动物模型中的表达及其与神经元凋亡的关系。方法:应用Aβ_(1-40)侧脑室内持续给药建立AD大鼠模型;应用免疫组织化学检测周期素依赖性蛋白激酶Cdk4和周期素cyclin B1的表达;应用TUNEL方法检测神经元的凋亡;应用荧光双标的方法确定Cdk4表达的细胞类型,同时还进行了Cdk4及cyclin B1与TUNEL的荧光双标实验。结果:(1)Cdk4和cyclin B1于造模后7天就达较高水平,21天达高峰,直到28天仍然持续表达;(2)AD动物模型组TUNEL阳性细胞于造模后14天开始出现,21天达高峰并且少量持续存在;(3)存在Cdk4与神经元标志性抗体的双标阳性细胞;(4)发现Cdk4和cyclin B1与TUNEL的双标阳性细胞。结论:Cdks参与了Aβ毒性引起的神经元凋亡机制,Cdks抑制剂可能减少神经元凋亡的发生。 第二部分Cdks抑制剂3’单肟靛玉红的药物代谢动力学研究 目的:本实验研究IMX在体内的药物代谢动力学过程及其能否进入脑内,为其临床应用提供了理论依据。方法:利用高效液相色谱法(HPLC)测定大鼠血液中IMX的含量;分别研究静脉注射、腹腔注射两种给药途径后,IMX在大鼠体内的药物代谢动力学特点,应用3P87药物代谢动力学程序,计算出主要的药物代谢动力学参数;并进一步观察了静脉给药后药物在动物体内主要器官心、肺、肾、脑组织中IMX的含量。结果:(1)鼠尾静脉注射IMX,药物代谢动力学符合二室模型。IMX在鼠体内吸收快,分布也快,药物起效快,在体内主要以消除过程为主,药物在体内滞留时间较长;(2)腹腔注射IMX后,在150min血药浓度达峰值。静脉注射10mg/kg IMX,于不同时间处死,用HPLC测定各组织中IMX的含量,结果发现IMX在心脏组织中含量较高,在1h达峰值;脑组织、肺组织中IMX含量在0.5h即达峰值;肾脏组织中IMX含量在3h达峰值,结合其化学结构特征推测,IMX易于透过血脑脊液屏障,以被动扩散为主,IMX主要分布在体循环和血流丰富的脏器中。结论:应用HPLC法测定大鼠血浆中IMX的浓度,操作简便、省时、精密度及重现性均较好。静脉注射IMX,药物代谢动力学符合二室模型,IMX在鼠血中主要以消除过程为主,IMX主要分布在血流丰富的组织中,分布速率较快。IMX易于透过血脑脊液屏障,以被动扩散为主。 第三部分IMX对AD动物模型行为学的影响及其神经保护机制研究 目的:研究IMX对AD大鼠神经元凋亡和学习记忆功能的影响及可能的神经保护机制。方法:应用Aβ_(1-40)侧脑室给药建立AD大鼠模型。成年健康雄性SD大鼠40只,随机分成:假手术组、AD模型组、IMX干预组Ⅰ(7.5mg/kg i.p.)、IMX干预组Ⅱ(15mg/kg i.p.)。IMX干预组在造模前1天经腹腔给药。造模后第7、14、21天行Morris水迷宫实验观测大鼠的学习和记忆功能的改变;行为学测试结束后应用组织切片原位末端标记(TUNEL)技术对额颞叶皮层和海马CA1区神经元的凋亡进行分析;应用Western blotting技术检测Cdk4和周期素cyclin B1的表达;同时还观察IMX对Cdc2激酶和ChAT活性的影响。结果:(1)Morris水迷宫实验显示IMX治疗组Ⅰ和IMX治疗组Ⅱ大鼠的平均逃避潜伏期分别为58.7±6.34s和48.8±7.83s较AD模型组(66.9±6.52s)明显缩短,t=2.85(IMX治疗组Ⅰ,P<0.05),t=5.62(IMX治疗组Ⅱ,P<0.01)。在第22天的空间探索实验中,IMX治疗组Ⅰ和IMX治疗组Ⅱ大鼠在原安全岛所在象限的搜索距离较AD模型组明显增加;(2)TUNEL原位检测显示AD模型大鼠的皮层和海马CA1区神经元凋亡明显增加,凋亡百分率为35.88±6.26%和11.21±2.15%;(3)IMX干预组Ⅰ大鼠的皮层和海马CA1区神经元凋亡百分率为13.22±5.23%和3.65±0.75%,低于AD模型组;IMX干预组Ⅱ大鼠的皮层和海马CA1区神经元凋亡百分率为11.91±3.34%和2.58±0.57%,低于AD模型组;(4)与AD模型组相比,IMX干预组Cdk4和cyclin B1的表达减少、Cdc2激酶活性下降和ChAT活性升高。结论:Cdks抑制剂IMX可以改善AD大鼠的学习记忆功能,减少Aβ诱导的额颞叶皮层和海马CA1区神经元凋亡。IMX改善AD大鼠的学习记忆功能可能与其抑制Cdks有关。……