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梨自交亲和性变异的分子机理研究

吴华清

   本文以奥嗄二十世纪、金坠梨及大果黄花3个自交亲和性突变品种为试材,应用现代分子生物技术等手段,研究了突变品种及其原始品种授粉生物学特性、S-RNase基因型、S-RNase基因的表达以及在后代中的分离规律等,主要的结果如下: 1奥嗄二十世纪自交亲和性突变的分子机制 田间授粉结果表明奥嗄二十世纪及其后代秋荣和54S-135自花授粉能够结实,座果率达88%以上,为自交亲和性品种,而它的原始品种二十世纪自花授粉结实率低,仅有7%,表现自交不亲和性。而在相互授粉时,奥嗄二十世纪雌蕊接受二十世纪和54S-135的花粉而受精结实,但二十世纪雌蕊拒绝奥嗄二十世纪和54S-135的花粉,证实奥嗄二十世纪仅是雌蕊发生自交亲和性突变(S_2S_4~(SM),SM=stylar-part mutant,花柱突变体),花粉与其原始品种一样,自交不亲和性功能正常。 PCR检测供试品种花柱S-RNase基因的结果显示,奥嗄二十世纪的花柱S_2-RNase基因与其原始品种二十世纪完全一样,而S_4-RNase基因比其原始品种二十世纪的少,并在花柱中正常转录;而且,IEF-PAGE也检测到奥嗄二十世纪花柱中微量的S_4-RNase蛋白,并且在柱头上的表达量与二十世纪的无明显差异,表明S_4-RNase基因确实在奥嗄二十世纪基因组中存在并在柱头上正常表达。但是在其后代基因组中不能检测到S_4-RNase基因,也不能检测到S_4-RNase mRNA和S_4-RNase蛋白,表明奥嗄二十世纪中少量的花柱S_4-RNase基因不能遗传给后代。从奥嗄二十世纪的自交后代中S-RNase基因的分离特性来看,S_2S_4~(SM)和S_4~(SM)S_4~(SM)分离比例为1∶1,从分子水平印证了与前人的结果。 本研究的结果认为奥嗄二十世纪含有少量的S_4-RNase基因,并在柱头上正常表达,但是不能遗传给后代,含有S_4~(SM)等位基因的后代S_4-RNase基因缺失,表现自交亲和。 2金坠梨自花授粉结实的机制 田间授粉试验结果显示,鸭梨自花结实率仅2%,自花花粉管在花柱中上部已经停止生长,而金坠梨自花结实率高达76%,自花花粉能正常生长至花柱基部;相互授粉时发现,鸭梨花柱能够接收金坠梨花粉并受精结实,而金坠梨花柱却与鸭梨花粉杂交不亲和。这些结果初步表明金坠花柱自交不亲和性功能正常,而花粉发生变异。 鸭梨和金坠梨基于S-RNase基因的S基因型完全一致,均为S_(21)S_(34);进一步克隆两品种S-RNase基因cDNA全长序列,并进行比较分析。结果显示,该两品种的1对雌蕊S-RNase基因在核苷酸序列上完全相同;RT-PCR分析结果表明,两个品种的1对S-RNase基因均正常表达,表达量也没有明显差异,从分子水平上证实了金坠梨在花柱方面和鸭梨并无差异,而是花粉自交不亲和性功能发生变异,导致了自交不亲和性功能的丧失,表现出自花授粉能够结实。 进一步分析金坠梨自交后代中S-RNase基因的分布,结果显示,在17个后代中均能检测出S_(34)-RNase基因,但是只在8个后代中检测到S_(21)-RNase基因,因此这8个后代居于S-RNase的S基因型与其亲本一样为杂合体S_(21)S_(34),而其余的9个后代则为S_(34)纯合体,即S_(34)S_(34),而没有发现S_(21)S_(21)纯合体后代,S_(21)S_(34)∶S_(34)S_(34)=8∶9≈1∶1。该结果表明,金坠梨的S_(21)单元型花粉SI功能正常,只有S_(34)单元型花粉发生变异,因而其S单元型应该为S_(21)S_(34)~(PPM)(PPM=pollen-part mutant,花粉突变体),但S_(34)单元型花粉究竟究竟是如何突变,是由于两个S单元型花粉S基因发生异源二倍体化,即单个花粉中包含两个不同S单元型的花粉S基因,从而因“竞争型相互抑制”导致自交亲和,还是因花粉S基因本身发生变异引起自交亲和,需要等梨花粉S基因鉴定出来后,通过比较分析鸭梨和金坠梨两者花粉S基因是否有差异,才能解开金坠梨自交亲和性突变之谜,但决不是因染色体倍性的改变导致自交亲和。 3大果黄花的自花授粉结实的机制 田间授粉试验结果显示,黄花梨自花授粉结实率仅为1.5%,属于自交不亲和性品种;而大果黄花自花授粉的结实率高达60%,属于自交亲和性品种;相互授粉时,黄花×大果黄花组合的坐果率达70%,为杂交亲和,但反交时坐果率为1%,表现为杂交不亲和;荧光显微镜观察这些组合授粉后花柱内花粉管生长情况,也得到相同的结果。这些结果表明,大果黄花雌蕊的自交不亲和性性状正常,但花粉发生突变。 进一步鉴定出了黄花和大果黄花基于S-RNase基因的S基因型,发现两者一样,均含有S_1-RNase和S_2-RNase基因;该两品种的这1对雌蕊S-RNase基因的DNA序列没有差异,而且均是特异性地在花柱中表达,表达量也没有明显差异,表明大果黄花和黄花的花柱S-RNase基因并无差异,雌蕊自交不亲和性功能均正常。 染色体数目观察结果显示大果黄花有68条染色体,而它的原始品种黄花含有正常的34条染色体,表明大果黄花为黄花的四倍体芽变,因而S基因型应该为S_1S_1S_2S_2。 进一步调查大果黄花自交后代S基因型,未发现S_1S_1S_1S_1和S_2S_2S_2S_2的纯和体后代,S_1S_1S_1S_2、S_1S_1S_2S_2和S_1S_2S_2S_2分离比例为6∶15∶6≈1∶2∶1,表明只有杂合二倍体花粉(S_1S_2)才能克服自交不亲和性,而纯合二倍体花粉(S_1S_1和S_2S_2)仍然表现正常的自交不亲和性,同时也表明两个花粉S基因本身正常。 所有这些证据表明,大果黄花的自交亲和性变异,是因染色体数目加倍而产生杂合二倍体花粉,进而导致了花粉自交不亲和性功能的丧失,表现出自花授粉能够结实,但花柱自交不亲和性功能以及花粉S基因本身正常。 本研究结果进一步阐明了雌蕊自交亲和性突变品种奥嗄二十世纪S_4-RNase基因的特性,首次澄清了国际上多年悬而未决的关于奥嗄二十世纪自交亲和性突变的分子和遗传机制,即S_4-RNase基因以嵌合体的形式,但不能传给后代。同时首次以两个梨花粉自交亲和性突变品种为试材,发现两者虽然表型一致(即均是花粉SI功能丧失),但应用两种不同的策略打破自交不亲和性,即大果黄花通过染色体加倍,产生异源二倍体花粉从而克服自交不亲和性,其自交后代居于S-RNase基因的S基因型均是杂合型,不会出现纯合体S基因型后代;而金坠梨采用的是另一种目前无法最终确定的方式来阻止自交不亲和性的发生,但肯定不是染色体倍性的改变,因为其自交后代中S基因型既有杂合体又有纯合体,而且染色体数目为34条。……   
[关键词]:梨(Pyrus);自交不亲和性;自交亲和性变异;S-RNase基因;S基因型
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:南京农业大学2006年