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深海适冷菌Pseudoalteromonas sp. SM9913胞外多糖的结构、生态学功能及其生物合成基因簇的克隆与分析

秦国奎

   海洋覆盖了超过75%的地表面积,这就提供了一个巨大的发现新化合物及其新用途的潜在资源。海洋中存在着种类繁多的微生物类群,是获取新药和新酶的宝贵资源,具有很好的开发前景。极端环境微生物是微生物学领域中研究的热点,适冷菌是极端微生物中的一类,在海洋中广泛分布,我们对来自海洋,特别是来自深海的适冷菌分泌的胞外多糖进行了较为系统的研究。 本论文的出发菌株P.Sp.SM9913,是本实验室从1855米深的Okinawa Trough(25°56’N,125°09’E)深海海底沉积物中分离得到,经过菌株鉴定为假交替单胞菌属的深海适冷菌。实验室早期的研究工作已经从P.sp.SM9913发酵培养液中分离纯化得到一种热不稳定的适冷蛋白酶MCP-01(Chen et al.,2002;Chen et al.,2003),并对这种适冷酶的性质做了详细的探讨。与此同时在适冷菌的胞外产物中分离得到了大量的胞外多糖,本论文的研究工作就是以适冷菌SM9913分泌的胞外多糖为研究对象展开,详细描述了其结构特征,揭示了胞外多糖在促进适冷菌适应低温、寡营养和不断流动的深海极端环境中所起到的重要的生态学功能。 P.sp.SM9913胞外多糖的发酵生产:本论文首先研究了培养温度和培养时间对适冷菌SM9913分泌胞外多糖的影响。研究发现,当P.sp.SM9913分别在10℃、20℃和30℃培养时,培养基中的总糖含量经过一个短暂的下降时期后开始缓慢回升最终达到最高。这个现象表明,培养初始阶段,P.sp.SM9913利用培养基中存在的糖组分进行自身的代谢生长过程,从而造成培养基中的总糖的消耗,导致糖含量的减少;之后菌株开始了胞外多糖的持续积累阶段,使胞外多糖产量最终达到最高。研究还表明,在一定温度实验范围内,P.sp.SM9913分泌的胞外多糖产量随温度的降低而增高,说明菌株自身的冷适应性。在最佳的培养条件下(15℃,52h),胞外多糖产量可以达到5.25g/L(干重),高于其它来源的适冷微生物所分泌的胞外多糖产量(Maucuso Nichols et al,2004),具有潜在的应用前景。 P.sp.SM9913胞外多糖的分离纯化:发酵液离心除菌体后,经减压浓缩、活性炭脱色、Sevag法去蛋白、乙醇沉淀、透析和低压冷冻干燥后得到胞外多糖的粗品。多糖粗品经Sephadex G-100凝胶过滤层析柱用0.1mol/L NaCl洗脱液进行洗脱,分别得到两个含糖单峰。使用苯酚一硫酸法检测发现第二个峰糖含量很少,所以我们只对第一个糖组分进行了收集和进一步的纯化。收集的糖组分浓缩后,再经过DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱,用0-1.0 mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱后得到含糖部分峰DS-EPS01,经过冻干后的DS-EPS01多糖样品为白色固体状。DS-EPS01的均一度采用Shimadzu HPLC分析系统检测验证只有一个单一对称的尖峰出现,说明该多糖样品中仅有单一组分存在,其纯度和均一度达到了色谱纯,符合进一步结构分析的要求。同时,经过HPLC系统鉴定,胞外多糖DS-EPS01的分子量为4×10~4Da。 P.sp.SM9913胞外多糖的组成和结构分析:糖组成分析结果表明DS-EPS01的主要成分是葡萄糖,同时含有少量的阿拉伯糖、木糖和甘露糖,没有发现氨基的存在。糖键型主要是以6-Glc连接为主,其它的连接方式还有少量的t-Gal、4-Glc、4-Xyl、和3,6-Glc。这些研究结果说明,高度乙酰化的α-(1→6)-Glc构成多糖主链的核心结构(61.8%),其它成分包括terminal arabinofuranosyl(t-Araf,11.0%)和terminal glucopyranosyl(t-Glc,11.2%),同时多糖链的末端还存在少量的t-Gal(3.1%)、4-Xyl(f,3.9%)、4-Glc(5.0%)和3,6-Glc(4.0%)。这些结果同时也说明了胞外多糖重复糖单元中主要的连接方式是α-(1→6),这些都与核磁共振结果分析一致。 根据胞外多糖DS-EPS01的1D ~1H-NMR、~(13)C-NMR和2D ~1H-~1H COSY(correlation spectroscopy,phase sensitive)、HSQC(heteronuclear single quantum correlation)谱中得到的糖分子中氢(H)和碳(C)的信号,可以推断组成糖链基本单元的结构。完整的~1H-NMR谱说明在胞外多糖中,糖单元、乙酰基和羟乙基的比例为4∶5∶1,也没有氨基的存在,耦合方式和耦合常数分析说明重复糖单元中含有alpha-glucose骨架。~1H-~1H COSY和HSQc光谱的综合分析可用来分析糖残基自旋体系中H的化学位移,揭示其耦合方式和耦合常数,从而可以对组成胞外多糖重复单元的糖残基上C和H的化学位移进行归属。 综合DS-EPS01的单糖组成分析、甲基化分析、MS和1D和2D NMR分析所得到的数据推断,DS-EPS01是由高度乙酰化的α-(1,6)→葡萄糖组成的四糖重复单元所聚合的多糖,其四糖重复单元为: →6)-[3,6-O-acetyl]-α-D-Glcp-(1→6)-[3-O-acetyl]-α-D-Glcp-(1→6)-[3-O-acetyl]-α-D-Glcp-(1→6)-[3-O-acetyl]-α-D-Glcp-(1→胞外多糖DS-EPS01结构如下图所示: 胞外多糖DS-EPS01的结构与来自于热液口等其它区域的胞外多糖明显不同,其中包括南极Pseudoalteromonas属的细菌(Guezennec,2002;Mancuso Nichols et al.,2004)。胞外多糖DS-EPS01,其分子量为4×10~4Da,远远小于热液口来源的胞外多糖,并且与其它海洋细菌分泌的胞外多糖不同的是胞外多糖DS-EPS01不含有糖醛酸。虽然在其它南极或海冰细菌如CAM025和CAM036等细菌产生的胞外多糖中也发现了乙酰化基团的存在,但是在海洋细菌胞外多糖结构中含有如此丰富的乙酰化基团,到目前为止胞外多糖DS-EPS01是第一个发现,而其它热液口细菌的胞外多糖不含或含有很少的乙酰基(Guezennec,2002)。高度乙酰化的多糖结构能够改变多糖分子的定向性和横向次序,从而改变多糖的物理性质;乙酰基的引入使多糖分子伸展变化,最终导致多糖羟基基团的暴露,增加其在水中的溶解性,从而达到提高其生物活性的效果。 P.sp.SM9913胞外多糖的生态学功能:本论文在对深海适冷菌P.sp.SM9913所分泌的胞外多糖分离纯化和结构解析的基础上,详细探讨了胞外多糖DS-EPS01在P.sp.SM9913适应深海低温、寡营养、不断流动的极端环境中所起到的重要的生态学功能。 适冷蛋白酶MCP-01为P.sp.SM9913胞外分泌的主要蛋白酶,具有热不稳定性、容易自溶等特点。我们以前的研究工作表明自溶是适冷蛋白酶MCP-01热不稳定的主要原因(Chen et al.,2002;Chen et al.,2003),因此本论文对深海适冷菌SM9913胞外的两种产物—适冷蛋白酶和胞外多糖之间的相互作用,尤其是适冷菌株分泌的大量的胞外多糖对适冷蛋白酶热稳定性的影响进行了详细的研究。研究结果表明,采用蛋白酶活测定方法于40℃下在适冷蛋白酶中添加胞外多糖溶液作用不同时间后,发现胞外多糖DS-EPS01对适冷蛋白酶酶活具有保护作用,能够明显增强适冷酶的热稳定性,在所测试的150min内适冷蛋白酶MCP-01的酶活没有明显的降低;利用毛细管电泳检测技术于40℃下在适冷蛋白酶中添加胞外多糖溶液作用不同时间后,发现胞外多糖DS-EPS01能够很好的阻止适冷蛋白酶MCP-01的自溶,进一步验证了胞外多糖在增强适冷酶热稳定性中的重要作用。这些体外试验表明,深海适冷菌P.sp.SM9913所分泌的胞外多糖可以有效的阻止适冷蛋白酶MCP-01的自溶,并对其稳定性具有很好的保护作用,并且对适冷菌及其所产生的结构比较柔性的适冷蛋白酶MCP-01在深海低温、寡营养、不断流动的极端环境中维持细胞的完整和酶构象的稳定、防止自溶的发生等方面都起到了重要的生态学功能。 胞外多糖DS-EPS01对各种金属离子鳌合的实验结果表明,胞外多糖DS-EPS01对Fe~(2+)(85.00%)、Zn~(2+)(58.15%)、Cu~(2+)(52.77%)和Co~(2+)(48.88%)具有很好的吸附作用,对Mg~(2+)(30.69%)和Mn~(2+)(25.67%)也有较好的吸附效果,但对Cr~(6+)(5.15%)几乎没有吸附作用。这些结果说明,胞外多糖DS-EPS01有助于P.sp.SM9913在营养缺乏的深海环境中富集金属离子。胞外多糖DS-EPS01的絮凝实验说明,胞外多糖DS-EPS01可以聚集溶液中的悬浮颗粒,是一种吸收效果非常好的絮凝剂,因此胞外多糖DS-EPS01有助于P.sp.SM9913在极度营养缺乏的流动深海环境中有效的富集营养颗粒。 以上实验充分证明了胞外多糖DS-EPS01可以有助于P.Sp.SM9913富集深海环境中的朊蛋白颗粒和痕量金属离子以提供营养和稳定适冷蛋白酶,从而避免其自溶。 P.sp.SM9913胞外多糖的生物合成基因簇的克隆与分析:本论文进一步的工作是在基因水平上来揭示深海适冷菌P.sp.SM9913适应深海生态环境的遗传学基础,最终阐明胞外多糖在深海适冷菌SM9913适应深海极端环境的分子机制。首先完成了与胞外多糖生物合成和分泌相关的基因簇序列的全部克隆,并提交到GenBank数据库中,对基因簇中全部ORFs进行了功能注释分析并绘制了胞外多糖生物合成基因簇的遗传图谱。胞外多糖生物合成基因簇总长为13,062 bp,共有包括epsPTUABCDGFEHISD等13个ORFs存在,平均G+C%为35.71%。利用同源性比对及生物学软件分析对每个ORFs进行了定位,对其相对应的功能进行了预测分析。研究表明,在此基因簇中具有编码特异糖基转移酶的多个基因、参与聚合和输出过程的基因以及涉及多糖转运和修饰的基因。epsA和epsS涉及胞外多糖的聚合和输出;epsB、epsC、epsD、epsG、epsF和epsE分别编码各种特异糖基转移酶;epsH涉及胞外多糖的乙酰化修饰;关键基因epsT编码UDP-glucose lipid carriertransferase,为胞外多糖生物合成的第一步,起着非常重要的调控作用;另外,到目前为止没有发现与基因epsP、epsU和epsI相对应的功能试验数据,因此无法推测这三个基因在基因簇中详细的功能。 与其它细菌胞外多糖生物合成基因簇相比较发现,我们所完成的EPS生物合成基因簇中各个基因都有着与其它基因簇中各个基因相对应的类似的功能,基因编码的产物分别在胞外多糖的生物合成过程中起着重要的作用。该工作也是目前国际上关于深海适冷菌胞外多糖生物合成基因簇相关研究的首次报道,具有重要的理论和实际意义,为胞外多糖在菌株适应极端深海环境中的作用提供了充分的证据。结合对多种细菌的胞外多糖的研究,提出了关于深海适冷菌P.sp.SM9913适应低温、寡营养和不断流动的深海极端环境的分子机制: 1.大量分泌的胞外多糖不能作为深海适冷菌的碳源和能源,氨基酸发酵才是菌株能量和碳的主要来源。 2.多种适冷蛋白酶类的存在能够保证深海适冷菌能够在低温环境中快速降解蛋白颗粒以供菌株自身代谢需求。 3.多种氨基酸运输和蛋白降解酶类、多种肽酶以及多种氨基酸和肽的吸收转运系统和信号传导系统的存在可以使深海适冷菌能够有效降解吸收深海中存在的有限蛋白颗粒,保证菌株可以在极端营养缺乏的条件下生存。 4.深海适冷菌表面分泌的大量的胞外多糖是一个重要的介质。在流动的深海环境中,一方面,胞外多糖可以介导细菌表面细胞之间的黏附聚集形成菌群来抵抗不良环境;另一方面,胞外多糖可以吸附聚集存在于流动海水中的朊蛋白颗粒和金属离子等营养物质以供菌株生长所需,并且可以介导菌株表面形成一种“Biofilm”的聚集体以利于菌株对营养物质的有效降解利用。菌株产生大量的适冷蛋白酶后,在胞外多糖的保护作用下可以降解这些聚集的蛋白颗粒,经消化吸收后转运到菌体内,供菌株自身代谢所用,或通过菌株表面的胞外多糖作用为菌群所用。 综上所述,在深海底群落中,细菌胞外多糖在菌株的生长、代谢、聚集等生存过程中扮演着非常重要的生态学作用,也是适冷菌适应低温、寡营养和不断流动的深海极端环境的重要保证。 本文相关工作中属国际上首次获得和提出的结果及推论: 1.首次系统的研究了深海适冷菌所分泌的胞外多糖的分离纯化过程,并解析了所纯化的胞外多糖DS-EPS01的结构,其胞外多糖的结构新颖,与其它海洋细菌胞外多糖有着明显的不同,为国际上首次报道。 2.首次对深海适冷菌胞外多糖的生态学功能进行了详细的研究,根据充分的实验证据,首次提出了深海适冷菌所分泌的胞外多糖可以有效阻止适冷蛋白酶自溶,起到稳定适冷蛋白酶的作用,进一步提出了胞外多糖在深海适冷菌适应低温、寡营养和不断流动的深海极端环境中所起到的重要的生态学功能。 3.首次获得了深海适冷菌胞外多糖生物合成基因簇的全序列并对其进行了功能注释;结合对多种细菌的胞外多糖的研究,首次提出了P.sp.SM9913适应低温、寡营养和不断流动的深海极端环境的分子机制,并且绘制出了P.sp.SM9913在深海生态系统中的生活史原理示意图(FigureⅠ)。……   
[关键词]:深海适冷菌;Pseudoaltermonas sp.SM9913;胞外多糖;生态学功能;胞外多糖基因簇
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:山东大学2007年