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银纳米粒子与生物大分子相互作用的研究及其分析应用

郑金华

   核酸和蛋白质是生命活动中最为重要的两类物质。核酸是遗传的物质基础,在生物的生长、发育和繁殖等活动中具有十分重要的作用,核酸的结构直接影响其功能,并与致癌、抗癌有关。而蛋白质几乎参与所有的生命活动,是生物体含量最丰富的高分子物质,几乎所有的器官组织都含有蛋白质,生物体结构越复杂其蛋白质种类和功能也越繁多。因此研究核酸和蛋白质与小分子相互作用,建立高灵敏度、低检测限的核酸和蛋白质的定量测定方法,在新型的药物设计、抗癌药物的药理和毒性的研究,以及临床检测等方面具有重要意义,是当前生物分析化学研究的前沿和热点之一。 本论文从寻找新的核酸和蛋白质探针,以建立灵敏的定量检测的方法出发,以荧光和共振光散射技术为主要研究手段,同时应用吸收光谱技术,圆二色光谱技术,表面张力测定技术,电势电泳技术,透射电子显微技术等手段进行了机理研究和探讨。本文共四部分。 论文的第一部分综述了核酸和蛋白质发光探针以及纳米粒子作为探针在生物分析中的研究进展及分析应用。 在论文的第二部分,研究了桑色素、纳米银和核酸的相互作用。采用柠檬酸钠还原法合成了粒径大约为15nm的银纳米粒子,利用新合成的银纳米粒子与桑色素-核酸体系相互作用。研究表明,桑色素-纳米银能选择性的识别双螺旋核酸中的鱼精子DNA,当向桑色素中加入纳米银时,桑色素的荧光显著猝灭,而核酸(fsDNA和smDNA)的加入,又使得体系的荧光显著的增强,且荧光的增强程度与核酸的浓度在一定范围内具有良好的线性关系,据此建立了选择性检测鱼精子DNA的新方法。fsDNA和smDNA的线性范围分别为:1.0×10-8-2.0×10-5 g/mL,和4.0×10-8-2.0×10-5g/mL,检出限分别为1.2×10-10g/mL和1.7×10-10g/mL,并成功应用于合成样品中fsDNA的定量测定。morin-nanoAg与fsDNA的相互作用机理研究表明:morin-nanoAg与fsDNA之间主要为沟槽式结合,并存在着分子间作用力;三者相互作用形成了立方型的银纳米晶,同时体系的微环境也发生了变化(即极性的减小和微粘度的增大)从而导致体系的荧光大大增强。 论文的第三部分中,以阳离子表面活性剂CTMAB和CPB为代表,研究了核酸对纳米银-阳离子表面活性剂体系的共振光散射的猝灭效应。研究发现,核酸的加入可以使纳米银-阳离子表面活性剂体系的共振光散射强度大大猝灭,由此建立了一种测定核酸的简单、灵敏的共振光散射法。在最佳实验条件下,建立了核酸浓度与猝灭的共振光散射强度之间的线性方程。在nanoAg-fsDNA-CTMAB体系中,fsDNA,ctDNA和yRNA的线性范围分别为:4.0×10-9-2.0×10-6g/mL,7.0×10-9-1.8×10-6g/mL和6.0×10-9-1.0×10-6 g/mL,检出限分别为2.7×10-10 g/mL,4.8×10-10 g/mL和7.2×10-10 g/mL;在nanoAg-fsDNA-CPB体系中,fsDNA,ctDNA和yRNA的线性范围分别为:1.0×10-8-4.0×10-6g/mL,4.0×10-8-4.0×10-6 g/mL和1.0×10-8-2.0×10-6g/mL,检出限分别为1.7×10-10 g/mL,4.8×10-10 g/mL和1.5×10-10 g/mL。该法已应用于实际样品拟南芥中核酸的定量测定,得到满意的结果。机理研究表明,阳离子表面活性剂可以通过静电引力以及疏水作用与银纳米粒子和核酸发生相互作用,使得体系中纳米银的排列有序或分散,导致了体系共振光散射强度的猝灭。另外还从表面活性剂表面张力、紫外-可见吸收光谱、圆二色光谱、体系微环境的变化等方面比较了CPB与CTMAB对体系共振光散射影响的不同。 论文的第四部分中,研究了银纳米粒子对血清蛋白质的表面荧光增强效应。利用沉积法在石英片上制备了银岛膜,并将胶原蛋白作为银岛膜和血清蛋白质的隔离介质,建立了灵敏的血清蛋白质的定量测定方法;研究了胶原蛋白和银岛膜的最佳厚度、浓度和吸附时间对体系荧光强度的影响。在最佳实验条件下,体系荧光增强的程度与血清蛋白质的浓度成线性关系,BSA和HSA的线性范围分别为1.0×10-7-4.0×10-5g/mL和1.0×10-7-7.0×10-5g/mL,它们的检出限(S/N=3)分别为3.6×10-9g/mL和3.6×10-8g/mL。我们认为,银岛膜通过等离子体共振增强了入射光的能量,调整了附近荧光分子的辐射速率,增强了入射局域场,使得附近的荧光体分子的荧光强度得到增强。 本论文的主要特点: 1、研究发现桑色素-纳米银能选择性的识别双螺旋核酸中的鱼精子DNA,从而建立了灵敏而简单的选择性检测鱼精子DNA的荧光新方法,同时还通过透射电镜、紫外吸收光谱、圆二色光谱、荧光寿命等手段探讨了体系的作用机理,发现纳米银在桑色素和DNA协同作用下,可以进行有序自组装成单分散银纳米晶,且其体系的荧光增强和银纳米晶的晶型结构有关。 2、研究发现,核酸对纳米银-阳离子表面活性剂的共振光散射有明显的猝灭作用,并已将该体系应用于实际样品拟南芥中核酸的定量测定。机理研究表明,阳离子表面活性剂可以通过静电引力以及疏水作用与银纳米粒子和核酸发生相互作用,使得体系中纳米银的排列有序或分散,导致了体系共振光散射强度的猝灭。本方法为核酸的定量测定提供了一个新的发光探针,本方法还具有操作简便、快速、线性范围宽、灵敏度高等特点,成为核酸灵敏的发光测定方法之一。 3、利用适宜厚度的胶原蛋白作为介体,研究了银纳米粒子表面荧光增强测定血清蛋白质的新方法。即在合适的入射角度下,与金属纳米粒子有一定距离的荧光分子的荧光强度可以被明显的增强,研究了银纳米粒子对血清蛋白质体系的荧光增强效应。……   
[关键词]:银纳米粒子;核酸;蛋白质;阳离子表面活性剂;荧光;共振光散射
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:山东大学2007年