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脂肪酶的生产及其在布洛芬手性拆分中的应用基础研究

唐良华

   布洛芬(Ibuprofen)等手性化合物分子的立体构型决定了其生物活性,如布洛芬分子在β位有一个手性碳原子,存在一对光学异构体——S(+)和R(-)两种对映体,其中,只有S(+)—布洛芬具有主要的生理活性,而R(-)构型对映体活性低、有副作用。近年来兴起的利用脂肪酶催化进行拆分的方法显示出独特的优越性,具有反应条件温和、选择性高、副反应少和环境污染小等优点。脂肪酶作为一种特殊而有效的生物酶催化剂,越来越受到人们的重视。本文对高立体选择性脂肪酶产生菌的筛选、微生物脂肪酶的发酵生产、脂肪酶的纯化及酶学性质、脂肪酶的固定化及固定化酶的酶学性质、外消旋布洛芬的酶法拆分、非水相中酶立体选择性的调控、酶促拆分反应动力学以及固定化酶的反应器等进行了研究。 从实验室已有的脂肪酶产生菌中,筛选并初步确定Bacillus coagutans ZJU318和Penicilliumexpansum TS414为立体选择性催化拆分(R,S)一布洛芬的脂肪酶产生菌。试验结果表明,筛选得到的菌株所产生的脂肪酶具有良好的立体选择性。 在单因子试验的基础上,综合运用均匀设计法,对Bacillus coagulans ZJU318、P.expansumTS414液体发酵产生脂肪酶的工艺参数进行了快速优化。优化后,上述两种菌的产酶水平分别比原来提高了约3倍和2倍,其中,P.expansum TS414的产酶水平高达315 U/mL。 Bacillus coagulans ZJU318脂肪酶(BCL)和P.expansum TS414脂肪酶(PEL)经两步层析纯化后,分别被纯化了14.7和81.8倍,并且达到了较高的纯度,在SDS—PAGE胶上均表现为一条带。经过SDS—PAGE法测定,Bacillus coagulans ZJU318脂肪酶和Penicillium expansum TS414脂肪酶的分子量分别为32.08 kDa和28.8kDa。对纯酶的酶学性质的研究结果表明:Bacillus coagulansZJU318脂肪酶(BCL)和P.expansum TS414脂肪酶(PEL)均属于碱性脂肪酶。其最适pH值均为19.0,在pH 8-10的范围内具有较为稳定的催化活力。 纯化后,Bacillus coagulans ZJU318脂肪酶(BCL)纯酶和Penicillium expansum TS414脂肪酶(PEL)纯酶对布洛芬对映体的对映体选择性表现出不同程度的升高。两种酶都优先催化S-布洛芬转化为相应的酯。其中,PEL表现出更高的催化活性和更好的布洛芬对映体选择性,在相同的反应条件下,PEL催化反应的底物转化率达到46-47%,产物对映体过量值达到99%,而底物对映体过量值也达到了90-92%。最终确定PEL是一种较理想的拆分外消旋布洛芬的工具酶。这是首次筛选和最终确定出:Penicillium expansum TS414脂肪酶(PEL)能够理想地高选择性地拆分(R,S)-布洛芬。 反应体系中水含量、“记忆”pH、反应温度、酰基受体以及有机溶剂对非水体系中PEL游离酶的的立体选择性都有重要的影响。采用1000U/mL PEL游离酶催化拆分(R,S)-布洛芬时,体系最佳的含水量为0.5%、“记忆”pH为9.0、反应温度60℃、酰基受体为1-丙醇、有机溶剂为异辛烷时,酶促反应的转化率(47%)及立体选择性(E值高达581)均达到最大值。 首次以大孔吸附树脂AB—8固定化Penicillium expansum TS414脂肪酶(PEL)在非水体系中高对映体选择性地拆分了(R,S)-布洛芬。与其它固定化载体相比,大孔吸附树脂AB—8固定化后PEL所催化的拆分反应的转化率(C)和对映体过量值(ee)以及对映体选择率(E)均达到了较为理想的结果。大孔吸附树脂AB—8固定化PEL具有较高的操作稳定性。连续10批(每批反应30h)拆分反应的平均转化率仍在47%以上,而且连续10批反应的ee_p值均稳定在98%以上。尤其是E值在第10批时仍高达380,远高于文献中有关(R,S)-布洛芬酶法拆分结果的报道。 固定化介质的类型、“记忆”pH值和体系含水量等对大孔吸附树脂AB—8固定化PEL酶促拆分(R,S)-布洛芬有较大影响。在以异辛烷为溶剂、“记忆”pH为9.0、含水量为0的体系中,40℃反应30 h后,拆分反应的转化率(C)可达47%,对映体过量值(ee)可达98.75%。大孔吸附树脂AB—8固定化处理对PEL在非水相中的酶学性质有重要影响。固定化后PEL在有机相反应体系中的分散性得到了极大的改善,从而极大地提高了酶促拆分反应的效率。 根据非水体系中(R,S)-布洛芬的酶促酯化拆分反应的机制,建立子(R,S)-布洛芬的酶促酯化拆分反应动力学模型。并对模型进行了拟合求解,并得到相应的动力学方程。将动力学模型拟合的曲线与实验实测数据的曲线进行比较,发现模型拟合值和实验实测值能够较好地吻合,说明该模型可以较好地描述大孔吸附树脂AB—8固定化PEL催化拆分(R,S)-布洛芬的酶促酯化反应过程。 对固定化酶的间歇搅拌釜式反应器(Batch Stirred Tank Reactor.BSTR)反应器进行了研究。利用均匀设计的实验方法对BSTR中进行酶法拆分的几个工艺参数进行了优化。优化的结果发现:在BSTR中进行拆分时,当反应体系(反应总体积为150mL)中布洛芬为200mg,固定化酶的加量为6g,1—丙醇为0.383mL时,反应只需12h时便可达到平衡。达平衡时,底物转化率接近50%,底物的对映体过量值达94%以上,而产物的对映体过量值也达到98%以上,且连续10批拆分反应的转化率和对映体过量值均保持在相当高的水平(连续10批反应的平均E值>380),显示该固定化酶反应器具有良好的操作稳定性。 本文在立体选择性微生物脂肪酶及其产生菌的筛选、均匀设计法快速优化产酶条件及BSTR工艺参数、非水相中脂肪酶的大孔吸附树脂固定化、固定化脂肪酶在非水相中的酶促拆分反应及机制等方面的研究工作具有明显的特色与创新,相关研究结果不仅具有一定的学术价值,而且具有重要的工业应用价值。……   
[关键词]:脂肪酶;布洛芬;筛选;发酵;纯化;酶学性质;大孔吸附树脂;固定化酶;反应动力学;酶反应器
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:浙江大学2007年