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广东道地药材广藿香的GC-MS化学指纹图谱和DNA指纹图谱研究

张英

   目的:广藿香Pogostemon cablin(Blanco)Benth.,别名刺蕊草、藿香,为药材和香料兼用的植物,隶属于唇形科(Lamiaceae)刺蕊草属(Pogostemon)。广藿香的干燥地上部分是其药用部位,味辛,微温,归脾、胃、肺三经,具有芳香化浊、开胃止呕、发表解暑的功能,用于湿浊中阻,脘痞呕吐,暑湿倦怠,胸闷不舒,寒湿闭暑,腹痛吐泻,鼻渊头痛,是治疗暑湿感冒的良药,并且是30多种中成药的组分之一。广藿香原产东南亚菲律宾、马来西亚、印度等国家,自宋代传入我国岭南地区,目前在广东省的广州郊区、肇庆地区、湛江地区、广西以及海南岛、福建、台湾等地均有栽培。根据产地的划分,广藿香药材的商品分为牌香(石牌藿香,广州产)、肇香(肇庆产)、湛香(湛江产)和南香(海南产)。不同产地的广藿香在形态和其它性状上都具有显著的差别,此外,传统认为前两者是道地药材,质量优,供药用,后两者质量较次,不供药用,仅用作提取广藿香油。广藿香自引入我国以来,形态上发生了很大的变异,随着广州城市化的不断扩建,“石牌藿香”已经出现濒危的局面,为了拯救优良品种,使其得到可持续性发展,本研究以不同产地的23个广藿香样本作为研究对象,采用分子标记技术和化学分析手段相结合的方法,明确广藿香的分子特征和化学特征,从而为鉴别广藿香的真伪以及道地性判定提供可靠的依据,并为广藿香的种质评价体系提供合理的技术平台和科学依据。 方法:研究内容分为四个部分:(1)首次采用加压溶剂提取技术(pressurized liquid extraction,PLE)提取不同产地的18个广藿香样品中的化学成分,并运用GC-MS方法对其进行分析和测定。(2)基于18个样品的特征峰,进行分级聚类分析,将18个样品分为不同的化学型并通过计算机辅助相似性评价系统对三个类型进行了相似性的评价,建立了不同产地广藿香的指纹图谱。(3)选取30条随机引物对不同产地的23个广藿香样本进行RAPD指纹图谱分析,并将同属另外两种植物长苞刺蕊草【P. chinensis C. Y. Wu et Y. C. Huang,PCH】和水珍珠菜【Pogostemon auricularius(Linn.)Hassk.,PAU】作为外类群参与比较。优化RAPD条件后,从30条随机引物中选出5条多态性高、重复性好的引物S42、S43、S224、S227和OPC-19对不同样本进行检测,并根据条带的差异进行聚类分析,构建不同产地广藿香的RAPD指纹图谱。(4)对不同产地的广藿香进行DNA序列分析研究,选取广藿香的18S rRNA、matK基因、ITS和5S非转录间隔区共四段序列进行检测,并通过对各样品进行聚类分析,考察其基因型和地理型相关性。 结果:(1)从广藿香中提取分离两个化合物广藿香醇和广藿香酮,并运用GC-MS方法对不同产地的广藿香样品进行分析和鉴定,确定包括广藿香醇和广藿香酮在内的10个特征性成分:β-广藿香萜烯、反-丁香烯、α-愈创木烯、刺蕊草烯、β-愈创木烯、δ-愈创木烯、广藿香烯醇、广藿香醇、环赛车烯和广藿香酮。结果表明不同产地的广藿香中各化学成分的种类和含量具有明显的差异。PLE和GC-MS的联合运用具有简单、快速、灵敏度高的优点。(2)基于18个样品的10个特征峰的聚类分析,可将18个样品分为三个类型:广藿香醇型、广藿香酮性以及基于两者之间的过渡型。通过计算机辅助相似性评价系统对三个类型进行了相似性的评价,建立了不同产地广藿香的GC-MS指纹图谱。指纹图谱的建立有助于区分广藿香的替代品和伪品,也有助于对国内不同地区的广藿香进行评价。(3)不同产地广藿香的RAPD指纹图谱研究表明,长苞刺蕊草和水珍珠菜的RAPD条带与广藿香相比具有明显的差异,不同产地的广藿香的RAPD标记也具有较明显的差异。将不同产地的广藿香进行聚类分析,同属种间的PCH和PAU与广藿香各样品的相似系数较低,多数情况下聚为独立的一组;广藿香样品G2、G3、G5、G19、G20、G21、G22、G23、G24、G26、G27、G28、G29、G30、G31和G32聚在一起;G8、G9、G10、G11、G12、G13和G16聚在一起。(4)对广藿香的18S rRNA、matK基因、ITS和5S非转录间隔区共四段序列进行检测,结果表明,不同产地的广藿香各段序列具有位点的变异。其中18S rRNA基因各样品长1809bp,第680位出现A和C的转换;matK基因序列长1216bp,有15个不同的碱基位点,分别位于第51、57、506、595、636、639、676、721、722、1158、1161、1198、1199、1214和1216位;ITS区序列(包含部分18S rRNA、5.8S rRNA和26S rRNA部分序列)总长度为824或825bp,共有不同碱基位点20个,其中ITS1区有18个,ITS2区有2个,20个差异位点分别是第38、52、79、82、157、199、205、222、224、251、291、292、373、392、405、415、437、469、520和669位;各样品的5S间隔区测得215个碱基,序列完全一致。通过对各样品进行聚类分析,发现其基因型和地理型具有显著的相关性:相同产地的样品遗传距离更接近,优先聚在一起;产地相近的样品聚在相近的组中,如广州和高要地区的样品,雷州和遂溪的样品,徐闻和海南的样品,相近的程度更高;组培苗样品在各段基因的比较中都聚为一组,并且和G5相聚,推测其亲代的组织来源于G5型植株。 结论:本文应用化学分析手段GC-MS分析技术,并借助分子生物学的平台——采用RAPD指纹图谱检测和DNA直接测序这两种分子标记技术,多角度阐明了不同产地广藿香的内在特征。本研究共采集不同产地的广藿香样本23个,其中属于广州郊区龙洞的样本有5个(G19、G29、G30、G31、G32),萝岗的样本6个(G5、G20、G21、G22、G23、G24),广东高要的样本4个(G2、G3、G27、G28),广东吴川的样本2个(G16、G26),广东遂溪的2个(G10、G11),广东雷州的2个(G8、G9),广东徐闻的1个(G13),海南的样本1个(G12)。 首次采用加压溶剂提取技术(PLE)和GC-MS综合应用,从不同产地的广藿香样品中共计分离并鉴定了10个化合物:β-广藿香萜烯、反-丁香烯、α-愈创木烯、刺蕊草烯、β-愈创木烯、δ-愈创木烯、广藿香烯醇、广藿香醇、环赛车烯和广藿香酮。基于18个样品的10个特征峰的聚类分析,将18个样品分为三个类型:广藿香醇型、广藿香酮性以及基于两者之间的过渡型。并通过计算机辅助相似性评价系统对三个类型进行了相似性的评价,建立了指纹图谱。指纹图谱的建立有助于区分广藿香的替代品和伪品,也有助于对国内不同地区的广藿香进行评价。 不同产地的广藿香的RAPD标记具有明显的差异,其基因的序列位点也有相应的变化,基因型和地理型具有显著的相关性;本研究结果表明高要的G2、G3、G27、G28基因型与广州龙洞的G19、G29、G30、G31、G32更加接近,这与传统认为的高要地区的广藿香质量比较接近“牌香”的说法相一致。除此之外,广东吴川所产的广藿香G16、G26也与上述产地的样品的基因型很接近,这与传统的说法是有出入的。据我们实地考察发现,吴川的广藿香的外在形态与G19等样品非常相似,推测是由人为干预种质选择等因素所造成的。 本研究从多个角度阐明了不同产地广藿香的化学和分子特征的异同点,首次全面系统的建立了广藿香的GC-MS化学指纹图谱库和DNA指纹图谱库,并在此基础上对不同产地的广藿香进行了考察和分类,发现广藿香的化学型、基因型和地理型三者之间具有显著的相关性。同时,本研究很大程度上丰富了广藿香的种质评价体系,为确保广藿香的药材质量及其资源的可持续利用,以及保护濒危资源石牌藿香提供了科学依据。在今后的工作中,我们希望能够结合更多的细胞学、药效学和临床应用方面的研究,建立更全面和完整的广藿香种质资源的评价体系,全面促进广藿香资源的可持续发展和利用。……   
[关键词]:DNA测序;GC-MS指纹图谱;广藿香;石牌广藿香;RAPD;种质;种质资源
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:北京中医药大学2007年