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低温蛋白酶的分离、纯化及其酶学性质研究

陆小波

   从昆明某肉联厂的冷库样品中分离到一株产低温蛋白酶菌株,经形态学和生理生化鉴定,结合部分16S rDNA序列分析,将其鉴定为肠杆菌科沙雷氏菌属,命名为Serratia sp.WJ39。 实验证明,Serratia sp.WJ39所产低温蛋白酶(pro-WJ39)为一胞外酶,菌株在13℃低温发酵后,收集发酵液,经过浓缩、硫酸铵沉淀、DEAE Sepharose~(TM) FF阴离子层析和Superdex 75凝胶过滤后,得到电泳纯的低温蛋白酶pro-WJ39。Pro-WJ39的比活由22.3U/mg提高到1,025U/mg,纯化倍数为46倍,回收率为6.5%。 通过酶学性质分析,证明pro-WJ39在0~37℃均具有较高的催化活力,其最适酶活温度为37℃,并在0~25℃之间酶保持稳定。酶反应的最适pH为10。Pro-WJ39具有较广的低温适应性,在0℃时仍有近35%的总酶活。 经过SDS-PAGE和Superdex 75凝胶过滤法对酶分子量进行测定后表明,该酶的相对分子量为47.6kD,为一单体蛋白。 研究还发现,金属离子K~+、Na~+、Ca~(2+)对pro-WJ39有一定的激活作用,而Cd~(2+)、Cu~(2+)、Ni~(2+)、Mn~(2+)则对其有部分的抑制作用,在本实验中使用的金属离子中没有发现能够明显抑制或激活该酶的金属离子,表明该酶对于金属离子具有一定的耐受性。同时SDS、乙腈、丙酮等对该酶均有一定的抑制作用。PMSF能强烈抑制该酶活性,1mmol/L的PMSF就能完全抑制酶活,证明pro-WJ39应属于丝氨酸蛋白酶。 以干酪素为底物时,酶的Km值为0.875mol·L~(-1),Kcat/Km值为2.313×10~5 mol~(-1)·L·S~(-1),证明该酶为典型的低温酶,并且与干酪素底物的结合能力和酶催化底物的能力均优于目前所报道的其它低温蛋白酶。Pro-WJ39的Ea值为23.0kJ/mol,不仅大大低于中温蛋白酶的值,而且也低于目前已知的其它低温蛋白酶的Ea值(36.9~38.0KJ/mol),表明pro-WJ39不仅与底物的结合能力较强,而且催化底物的效率也非常高。 另外,在蛋白质底物特异性的研究中发现,pro-WJ39对于多肽链中第一位氨基酸的a碳原子所连的R基团有明显的选择性,当R基团为甲基时,酶催化的能力最高,而对于含有芳香族的蛋白质底物的催化能力却很弱。 Pro-WJ39不仅温度适应性范围广,而且催化速度快,效率高,且具有广泛的金属离子耐受性,具有很好的工业生产应用潜能。……   
[关键词]:低温蛋白酶;沙雷氏菌属;酶学性质分析
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:昆明理工大学2007年