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分子佐剂hC3d3与hCGβ融合增强人外周免疫活性细胞对hCGβ抗原的反应性

李华萍

   目的从人肝cDNA文库克隆C3基因片段hC3d,将三个拷贝的hC3d与hCGβ基因融合,构建携分子佐剂的hCGβ-hC3d3融合蛋白和hCGβ蛋白的分泌型真核表达质粒,体外获得稳定高效表达细胞株,并获得较高纯度的目的蛋白hCGβ-hC3d3和hCGβ。目的蛋白体外作用于人外周血免疫细胞,以了解融合蛋白hCGβ-hC3d3的免疫原性及免疫效应,探讨分子佐剂hC3d的作用机制,为重组hCGβ-hC3d3融合蛋白疫苗最终用于人类奠定基础。 方法以人肝cDNA文库为模板,PCR扩增hC3d基因片段,插入pMD18-T simple载体,构建含三个拷贝hC3d的pMD18-T-hC3d3质粒;以phCMV1-6his-hCGβ为模板扩增带有相应酶切位点的hCGβ基因片段,将其构建入高效真核表达载体pCI-gs得到pCI-gs-signal-6His-hCGβ真核表达质粒。将hCGβ基因片段插入pMD18-T-hC3d3质粒,使hCGB与hC3d3基因融合,再构建入pCI-gs获得pCI-gs-signal-6His-hCGβ-hC3d3真核表达质粒。脂质体法介导重组质粒pCI-gs-signal-6His-hCGβ、pCI-gs-signal-6His-hCGβ-hC3d3转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,序列浓度MSX筛选抗性细胞克隆;化学发光法检测抗性克隆培养上清hCGβ含量,以选择高效表达克隆。Western blotting鉴定目的蛋白;Raji细胞免疫化学染色法鉴定hCGβ-hC3d3融合蛋白。采用针对6His的镍柱结合凝胶过滤层析纯化表达产物。 用L-亮氨酸甲基酯(L-LME)或B细胞磁珠阴性分离试剂盒对人外周血单个核细胞(PBMC)进行细胞分离纯化;实验分四组:B细胞、B+T细胞组、PBMC和Raji细胞组。分别应用1nM、10nM、100nM不同浓度的hCGβ、hCGβ-hC3d3及美洲商陆(PWM)等抗原体外作用于以上细胞10-12d,用ELISA检测培养上清中总免疫球蛋白(Ig)及抗hCGβ抗体的分泌水平;用氚标记的胸腺嘧啶核苷(~3H-TdR)掺入法了解不同抗原刺激后各组细胞增殖情况,而ELISPOT可测定各种抗原刺激后Ig或特异抗体的分泌细胞数量。另外,为探讨分子佐剂hC3d3的作用机制,用100nM的hCGβ、hCGβ-hC3d3或PWM等抗原与B细胞、B+T细胞、PBMC细胞体外作用48h,用ELISA检测培养上清中IL-2浓度;用荧光抗体标记培养细胞,流式细胞仪检测B细胞、T细胞表面协同刺激分子CD80、CD86、CD154的表达情况及Th细胞活化后IL-2Rα链(CD25)的表达水平。 结果分子克隆的hC3d基因片段的测序结果与目的基因一致。酶切鉴定及测序结果显示,pMD18-T-hC3d3、pCI-gs-signal-6His-hCGβ、pCI-gs-signal-6His-hCGβ-hC3d3重组质粒构建正确。转染CHO细胞后,经抗性克隆筛选,各挑选出一个高表达细胞株,化学发光法检测其培养上清中hCGβ的含量结果显示,pCI-gs表达效率明显高于pcDNA和phCMV1。Western blotting分析显示,pCI-gs-signal-6His-hCGβ的表达产物为24KDa;而pCI-gs-signal-6His-hCGβ-hC3d3的表达产物有三种,大小分别为136 KDa、100 KDa、64 KDa。镍柱结合分子筛纯化可获得较高纯度的融合蛋白hCGβ-hC3d3和hCGβ。 用不同浓度hCGβ、hCGβ-hC3d3及PWM作用于B细胞、B+T细胞、PBMC、Raji细胞10~12d后,~3H-TdR掺入法分析显示:与hCGβ处理组相比,融合蛋白hCGβ-hC3d3能使各组细胞增殖明显升高,且呈浓度依赖性。总Ig水平检测结果表明,100nM hCGβ-hC3d3与前三组细胞共培养上清中总Ig的含量分别为hCG B刺激组的4倍、10倍和10.85倍;且呈浓度依赖性。ELISPOT结果与上清检测结果类似,经与hCGβ-hC3d3共培养后Ig生成细胞较hCGβ组明显增加。用100nM的不同抗原共培养12d后,取培养上清进行ELISA检测,结果表明,经hCGβ及PWM刺激后,上清中均未检测到抗hCGβ特异性抗体;与hCGβ-hC3d3培养后则在B+T细胞、PBMC组可见低水平抗hCGβ抗体。用ELISPOT法分析抗hCGβ特异性抗体生成细胞,结果发现,hCGβ刺激的细胞仅有数个散在的阳性细胞;而经hCGβ-hC3d3刺激后,阳性细胞明显增多(P<0.05)。 流式细胞术分析结果提示:与hCGβ比较,hCGβ-hC3d3蛋白能显著上调B细胞表面CD80、CD86分子的表达,尤其是CD86分子的表达;能明显增强T细胞表面CD154、CD25分子的表达(P<0.05)。hCGβ-hC3d3蛋白能提高B细胞抗原提呈的能力及T细胞活化后分泌IL-2的能力(P<0.05)。 结论成功克隆了人hC3d基因片段,实现了hC3d3与hCGβ的基因融合;构建了pCI-gs-signal-6His-hCGβ,pCI-signal-6His-hCGβ-hC3d3真核表达质粒;并在CHO细胞中获得hCGβ蛋白、hCGβ-hC3d3融合蛋白的高效分泌性稳定表达。镍柱结合分子筛可获得较高纯度的目的蛋白。hCGβ-hC3d3可通过提高人外周血B细胞及T细胞表面协同刺激分子的表达,促进B细胞活化,改善其抗原提呈能力,加强B细胞T细胞间相互作用,有效活化T辅助细胞;分子佐剂hC3d能增强人外周免疫活性细胞对hCGβ抗原的反应性,显著提高B细胞合成Ig及特异性抗体的能力。……   
[关键词]:hCGβ;人分子佐剂hC3d;免疫避孕;抗hCGβ避孕疫苗;协同刺激分子;免疫效应
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:复旦大学2006年