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锯缘青蟹N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的性质及活力调控的研究

张继平

   以锯缘青蟹(Scylla serrata)内脏为材料,通过含0.2 mol/L NaCl的0.01 mol/L Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液抽提、硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-100凝胶柱过滤层析、DE-32离子交换柱层析,获得了比活力为7,990 U/mg的电泳单一纯N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶制剂(NAGase, EC 3.2.1.52)。该酶的等电点为4.68,分子量约为132 kD,每个酶蛋白分子含有约1097个氨基酸残基,其中非极性占39.1%,碱性占7.1%,酸性占24.0%,极性不带电荷的占29.8%。该酶含两个分子量约为65.8 kD的同型亚基,肽链间不含二硫键而肽链内含有二硫键。该酶为糖蛋白,其中含糖量为12.85 %(w/w)。以对-硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(pNP-NAG)为底物,测得该酶在0.05 mol/L NaAc-HAc缓冲液( pH 5.8 )中催化水解pNP-NAG的最适pH为5.6,最适温度为50℃;该酶在45℃以下,pH 4.6-8.6范围内稳定。pH 5.8下,酶水解pNP-NAG的米氏常数Km为0.424±0.012 mmol/L,最大反应速度Vmax为17.65±0.32μmol?L-1?min-1,反应的活化能为61.32 KJ/mol。 半胱氨酸的疏基、色氨酸的吲哚基、组氨酸的咪唑基、酸性氨基酸的β-羧基和赖氨酸的ε-氨基是酶的活性功能基团。精氨酸残基、丝氨酸残基不是酶的活性所必需。同时,酶分子链内二硫键的形成不是该酶活性所必需。30℃下酶活性中心解离常数pKe为5.40,解离热焓?Ho为7.812 kcal/mol,表明与酶活性有关的可解离基团是组氨酸的咪唑基;产物NAG与产物pNP的类似物苯酚、对羟基苯甲酸对酶的抑制作用表明,酶催化底物pNP-NAG水解反应属有序双双机理。在变性剂盐酸胍的作用下,酶分子的活力变化快于构象的变化,说明酶分子的活性中心处于对胍较敏感的区域。 养殖水体中富营养化产生的氨态氮,SO3-对酶有较强的抑制作用。水体主要有机污染物苯酚对酶有明显的抑制作用,与苯酚相比,邻苯二酚对酶的抑制作用减弱,对苯二酚对酶的抑制作用加强,对羟基苯甲酸的抑制作用最强,这种差异与苯环上基团的性质密切有关。 Cu~(2+)与底物竞争和酶结合产生抑制,Zn~(2+)对酶的抑制为混合型,Zn~(2+)使酶活力的变化快于构象的变化,而Cu~(2+)使酶构象的变化快于活力的变化。养殖水体常用消毒药物中,次氯酸钠、二氯异氰尿酸钠、三氯异氰尿酸、季氨盐、聚维酮碘、过氧化氢对酶的活力有不同程度的影响。同时,次氯酸钠、二……   
[关键词]:锯缘青蟹;N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶;性质;活力调控;动力学
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:厦门大学2006年