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单克隆抗体技术检测血清与组织糖基化终产物的初步应用

王碧蕾

   研究目的:为探讨糖基化终产物(AGEs)在糖尿病慢性并发症发生发展过程中的作用,本研究对已获得的5株抗AGEs单克隆抗体进行特异性及抗原表位的鉴定,并进一步制备出三株抗AGEs单克隆抗体,用所得单抗对糖尿病大鼠主动脉进行AGEs的western blot分析,并对糖尿病大鼠肾脏、心脏进行AGEs的免疫组化分析;为建立检测血清中AGEs浓度的微量测定技术奠定基础,为糖尿病慢性并发症的诊断、治疗及预后评估提供依据,用所得单抗通过western blot对正常对照、糖尿病及透析病人血清中的AGEs进行探查。 研究方法:间接酶联免疫吸附实验(ELISA)筛选培养上清,包被的抗原为纯化后的第一峰AGEs-HSA,选择对AGEs阳性,对HSA阴性的多克隆孔进行亚克隆,间接ELISA筛选亚克隆板孔的细胞培养上清。收集阳性单克隆细胞株,注射Babl/c小鼠制备腹水,经固相化甘露聚糖结合蛋白(MBP)柱纯化腹水。进行亚型鉴定,并通过间接ELISA、western blot对抗体行特异性鉴定并初步鉴别其所针对的抗原表位。应用所得抗AGEs单克隆抗体对正常对照组、糖尿病组及透析组人血清和糖尿病大鼠主动脉进行AGEs的western blot分析,并对糖尿病大鼠进行肾脏、心脏AGEs的免疫组化研究。 结果:1将冻存杂交瘤细胞复苏后,经筛选、亚克隆,得到3株阳性单克隆细胞株。扩增3株细胞株,取细胞培养上清行亚型鉴定为IgM型;2对已获得的5株及新制备的3株抗AGEs单克隆抗体细胞株进行扩增,注射小鼠腹腔产生腹水,经固相化甘露聚糖结合蛋白(MBP)柱纯化,抗体特异性鉴定示与AGEs-HSA特异性结合,而与对照物(人血清白蛋白、孵育人血清白蛋白、牛血清白蛋白)结合较低;3初步鉴别其抗原表位非羧甲基赖氨酸(non- carboxymethyl lysine);单抗相加实验证实各单抗间相加指数AI<50%;4在正常对照、糖尿病及透析组人血清中检测到葡萄糖源性AGEs;5用所得单抗行western blot,显示糖尿病高血压大鼠主动脉含AGEs特异显色,而正常对照组不明显;6应用抗AGEs单克隆抗体对糖尿病大鼠肾脏、心脏的免疫组化研究显示,在糖尿病大鼠肾小球系膜基质扩展区、结节性损伤区和心肌细胞内可见明显AGEs沉积,而正常对照组未见或仅见少量AGEs。 结论:8株抗AGEs单克隆抗体细胞株具有较高的抗原特异性,可定性显示血清和组织中的AGEs。……   
[关键词]:晚期糖基化终末产物;人血清白蛋白;单克隆抗体;糖尿病;免疫组织化学
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:东南大学2006年