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Morganella morganii J-8中羰基不对称还原酶的分离纯化及性质研究

卢燕

   随着医药、农业、食品、精细化工等行业对光学纯手性中间体需求的增长,人们已充分认识到手性的重要。酶法生物催化合成手性化合物因其独特的优势成为近年来国内外研究的热点。为深入研究该转化过程中酶反应机制,进行酶的分离纯化及酶学性质的研究,具有重要的现实意义和理论价值。 本实验室筛选得到的摩尔根氏菌(Morganella morganii )J-8菌株,可将底物1-苯基-2-甲氨基丙酮(MAK)专一性地转化为d-伪麻黄碱。本研究以Morganella morganii J-8为出发菌株,对其产羰基不对称还原酶的产酶条件、纯化以及酶学性质进行研究,结果如下: 经对产酶条件的优化,确定了产酶的较适培养基:葡萄糖3 %、蛋白胨2.5 %、酵母膏0.5 %、K2HPO4 0.3 %、MgSO4·7H2O 0.2 %、NaCl 0.2 %。最佳产酶条件是培养基初始pH 7.5,以24 h为最佳接种种龄;30℃,150 rpm摇床培养为36 h。 对粗酶的基本性质进行了研究,酶的最适作用温度和最适PH分别是30℃和7.5。在pH 5~8范围内酶的稳定性较好,35℃以下比较稳定。 菌体超声破碎后,经硫铵沉淀、Phenyl Superose疏水柱层析、DEAD阴离子柱层析和非变性凝胶电泳四步纯化获得SDS-PAGE电泳纯的羰基不对称还原酶。亚基分子量为42.5 kD。HPLC蛋白柱分析酶的分子量,分子量约为84.1 kD,初步认为该酶为二聚体蛋白。 对所得到的部分纯化酶的酶学性质做了初步研究,以NADH作为反应的辅酶时粗酶的酶活相对于以NADPH为辅酶时高,以MAK为底物,酶促反应的最适pH值为6.5,最适温度为30℃。该酶在35℃以下,pH 6~8范围内较为稳定。金属螯合剂及重金属离子会对该酶的活力产生抑制作用,金属离子之中,Mg2+和Mn2+对酶有一定的激活作用。 纯酶进行基质辅助激光解析电离-飞行质谱分析,检索所得有意义匹配蛋白为亮氨酸脱氢酶。……   
[关键词]:羰基不对称还原酶;发酵条件;优化;分离纯化;酶学性质
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:江南大学2006年