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禽流感病毒重组蛋白粘膜免疫研究及NP-ELISA抗体检测方法的建立

吴仁蔚

  禽流感(Avian Influenza,AI)是由禽流感病毒(Avian Influenza Virus,AIV)引起的禽类烈性传染病,世界各地都有AI的暴发和流行,给世界养禽业造成了巨大的经济损失。自1997年“香港禽流感”事件到目前为止,禽流感已造成了数百人感染及死亡,表明AI已经对人类健康构成了潜在的威胁,AI的研究具有重大公共卫生学意义。目前AIV的诊断有病毒分离鉴定、血凝抑制、琼脂扩散和RT-PCR等方法,但上述方法由于耗时或操作复杂或需要昂贵仪器等缺点,难以在基层推广应用,因此AIV的快速诊断已成为目前迫切需要解决的问题之一。胶体金免疫层析快速检测AIV方法简便、快速、直观,而研制抗不同表位的单克隆抗体是该方法建立的必需前提。本研究研制了8份抗H9N2亚型AIV的单克隆抗体,效价高,特异性强,且分属于AIV的几个不同的抗原表位,是胶体金免疫层析法快速检测AIV的重要材料。在研究敏感快速的诊断方法的同时,AI血清学抗体检测方法仍是重要的监测方法。本研究利用AIV核蛋白(Nucleoprotein,NP)具有型特异性的特点,建立了NP-ELISA抗体检测方法,可用于抗体的监测,为禽流感的流行病学调查提供了可靠的手段。AIV血凝素(Hemagglutinin,HA)是诱导动物机体产生中和抗体的主要免疫原,也是决定病毒变异、毒力和宿主特异性的主要因素。利用HA基因或蛋白研制的疫苗可对同一亚型不同毒株的攻击产生近100%的保护作用。但是不同HA亚型抗体之间没有交叉反应和交叉保护性,这就给AI的检测和预防带来了困难,而M2抗原是在所有流感病毒中最为保守的蛋白之一,M2产生的抗体能够为机体提供针对不同亚型病毒攻击的保护力,而且能明显抑制病毒在呼吸道中的复制,因此M2蛋白是研究交叉保护性疫苗的理想候选抗原。本研究将HA蛋白和M2蛋白分别或融合表达,以期为发展具有高效和交叉免疫保护力的新型疫苗奠定基础。AIV主要通过呼吸道和消化道侵入机体,因而粘膜免疫非常重要。霍乱毒素B亚单位(Cholera Toxin,CTB)可以有效诱发机体的粘膜免疫应答和分泌型IgA(Secretory IgA,sIgA)的产生。sIgA是粘膜免疫的主要效应因子,有抗蛋白酶水解作用,可长时间在消化道和呼吸道持续存在。特异性sIgA可在感染的最初阶段阻断禽流感病毒的侵入,因此,研究AIV主要抗原与粘膜免疫刺激物的互相作用,具有重要的理论意义和应用价值。本项目以H9N2亚型AIV为研究对象,用现代分子生物学方法和技术,着重进行了AIV主要抗原基因的克隆和原核表达研究;重组AIV-HA、M2蛋白粘膜免疫机制研究;AIV主要抗原蛋白单克隆抗体研究;以AIV-NP表达蛋白为包被抗原,建立了NP-ELISA抗体检测方法。研究内容如下:……   
[关键词]:禽流感病毒(AIV);HA1蛋白;sM2蛋白;NP蛋白;霍乱毒素B亚单位(CTB);原核表达;粘膜免疫;酶联免疫吸附试验(ELISA);单克隆抗体
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:华中农业大学2006年