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已烯雌酚单克隆抗体和酶标抗原的研制

古艳丽

   己烯雌酚(diethylstibestrol,DES)是一种人工合成的雌激素,在促进动物蛋白质的合成代谢、提高动物日增重和减少脂肪等方面效果明显,因此一直被作为一种动物生长促进剂用于畜禽以及水产品养殖中。国际癌症研究机构(IARC)研究发现,DES是一种致癌物质,能够在动物源性食品如肝脏、肌肉、蛋、奶中残留,并通过食物链危害人体健康。因此世界各国规定食品动物养殖中不得以任何途径和方式使用DES,养殖动物及动物性食品中不得检出DES。 DES残留免疫分析是DES应用监控的一种重要手段,本文通过DES人工抗原的制备和鉴定、抗DES多克隆和单克隆抗体的制备和鉴定、DES酶标抗原合成以及酶免疫检测DES方法的建立等研究,旨在研制DES酶免疫检测试剂盒。 对己烯雌酚进行了结构修饰,用有机合成方法合成了DES单羧甲基醚,并通过红外、质谱和核磁共振氢谱鉴定合成成功;通过混合酸酐法和碳二亚胺法分别将DES单羧甲基醚与大分子蛋白质载体牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清蛋白(OVA)偶联,合成了四种人工抗原,并通过紫外扫描和SDS-PAGE凝胶电泳鉴定偶联成功,其中BSA与DES的偶联率约为1:30,OVA与DES的偶联率为1:18。 用混合酸酐法合成的BSA-DES免疫4只家兔,用混合酸酐法合成的OVA-DES和碳二亚胺法合成的OVA-DES免疫两组小鼠,获得了3种抗血清,选用不同的包被原,通过间接ELISA和间接阻断ELISA法对3种抗血清进行了鉴定,兔血清抗体效价在1:10000以上,小鼠血清抗体效价在1:8000以上,三种抗血清都能和DES特异性结合,同时建立了ELISA检测方法。 选用混合酸酐法合成的BSA-DES免疫Balb/c小鼠,用碳二亚胺法合成的OVA-DES做包被检测原,间接ELISA检测小鼠血清效价均在1:1×10~5以上,选择其中效价最高的两只小鼠脾细胞,在PEG的作用下与SP2/0瘤细胞融合,通过间接ELISA法检测了单抗杂交瘤细胞培养上清中的抗体效价达1:400以上,同时建立了立了DES残留检测的酶免疫检测方法,其中检测限能达到0.2μg/Kg。 用碳二亚胺法合成了酶标抗原HRP-DES,通过ELISA法证明了HRP-DES的正确合成。同时,建立了竞争ELISA法检测DES残留,并绘制了检测曲线。本研究首先将DES衍生成DES单羧甲基醚,通过两种偶联方法和两种载体合成了四种不同的人工抗原,通过兔子和小鼠的免疫试验,成功制备了高效价特异性DES抗血清和单克隆抗体,建立了DES残留检测的竞争ELISA方法,同时成功制备了HRP-DES,为组装DES酶免疫检测试剂盒奠定基础。……   
[关键词]:己烯雌酚;人工抗原;单克隆抗体;酶标抗原;酶免疫分析
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:西北农林科技大学2006年