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镉致体外培养鸡支持—生精细胞凋亡机理的研究

张春红

   镉是一种工业上应用广泛的具有潜在毒性的重金属,已逐渐成为环境中重要的污染物之一。大量研究表明,镉能够引起雄性动物和人生殖机能减退,诱导生殖细胞凋亡、坏死等不可逆变化。但大多数试验集中于对啮齿类动物和人的研究,对于禽类的研究较少。本试验以体外培养鸡原代支持-生精细胞为研究对象,在培养液中加入不同浓度CdCl_2,通过对鸡支持-生精细胞活性、贴壁性能、细胞凋亡、抗氧化功能、DNA损伤、细胞内游离钙离子浓度及细胞内bcl-2、Fas、FasL、CaM、caspase-3mRNA表达水平等的检测,探讨了镉致鸡支持-生精细胞凋亡的机理。研究结果表明: 1.应用台盼蓝拒染试验、MTT比色法、二硝基苯肼比色法检测了支持-生精细胞的活性和培养上清液中LDH活性,并观察了细胞贴壁性能,结果表明镉能够抑制体外培养鸡支持-生精细胞的活性,影响支持细胞的贴壁性能及支持细胞与生精细胞之间的黏附力,同时测定了染镉24h对支持-生精细胞的半数抑制浓度为28.41±0.42μmol/L,表明镉对鸡支持-生精细胞具有毒性作用。 2.应用AO/EB双荧光染色法测定了染镉后支持-生精细胞的凋亡率和坏死率,结果表明,低浓度镉主要引起细胞凋亡,而高浓度镉使细胞凋亡和细胞坏死同时发生。 3.应用碱性单细胞凝胶电泳测定了镉对支持-生精细胞DNA的损伤效应,结果表明镉能够诱导鸡生殖细胞DNA损伤,这可能是其致禽类生殖细胞损伤的机制之一。 4.通过对细胞内抗氧化功能的检测,结果表明镉能够导致支持-生精细胞内SOD、GSH-Px活性下降,MDA含量增加,细胞抗氧化功能降低,发生氧化应激,这可能是镉诱导禽类生殖细胞凋亡的机制之一。 5.应用半定量RT-PCR法和荧光探针法检测细胞内CaMmRNA表达水平和游离钙离子浓度,结果表明镉能够引起细胞内CaMmRNA表达水平下降,游离钙离子浓度升高,干扰细胞钙离子的转运,导致细胞钙稳态失衡,这可能是镉诱导禽类生殖细胞凋亡的机制之一。 6.应有半定量RT-PCR法检测了鸡支持-生精细胞内bcl-2、Fas、FasL、caspase-3mRNA表达水平,结果表明镉能够降低了支持-生精细胞内bcl-2mRNA的表达水平,增加Fas/FasL和caspase-3mRNA的表达水平,进而诱导生殖细胞的凋亡。 本试验从细胞、分子水平上探讨镉致禽类生殖细胞毒性作用,揭示了镉能够降低生殖细胞的活性、诱发氧化应激、损伤细胞DNA、干扰细胞钙稳态、影响细胞内基因表达、诱导细胞凋亡,阐明了镉致禽类生殖细胞毒性机制,为畜禽镉中毒的防治提供了理论依据,丰富了毒理学和比较医学的资料,对保护畜牧业的健康发展,保护野生禽类,维持生态平衡具有重要意义。……   
[关键词]:;;支持-生精细胞;细胞凋亡;氧化损伤;钙稳态
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:东北农业大学2006年