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BLyS_(134-285)对噬菌体展示文库的筛选及其受体突变体的研究

丁艳丽

  B淋巴细胞刺激因子(BLyS)是1999年发现的肿瘤坏死因子(TNF)家族的一个新成员,主要调节B细胞的增殖、分化,BLyS表达异常会引起严重的免疫功能紊乱。本研究首先在大肠杆菌中对BLyS_(134-285)进行了可溶表达,获得了有活性的表达产物,以BLyS_(134-285)为靶蛋白对噬菌体随机12肽库进行亲和淘洗,筛选到一结合肽;其次将该肽与BLyS受体—B细胞成熟抗原(BCMA)胞外区序列比较,确定位点对BCMA进行了定点突变,并找到BCMA与BLyS_(134-285)结合的关键氨基酸;同时,我们用BLyS_(134-285)和FP248两种蛋白分别对噬菌体展示scFv文库进行淘洗,在获得各自高亲和力克隆的基础上,成功地将抗体噬菌体作为一抗在Western blot中应用,为Western blot中一抗的获得提供了一种新的途径。研究工作分为以下三个部分:(1)在大肠杆菌BL21(DE3)中以低温诱导获得了BLyS_(134-285)的可溶性表达,经过Ni-NTA树脂纯化表达产物,纯度达到80%左右;分离小鼠脾脏B细胞,用MTT法测定BLyS_(134-285)对其的增殖情况,证实了BLyS_(134-285)的活性。以BLyS_(134-285)为靶蛋白对噬茵体展示随机12肽库进行了筛选。经过3轮淘洗,噬菌体产出与投入的比值逐轮升高,表明与BLyS_(134-285)特异性结合的噬菌体得到了富集。在洗脱时我们采用了酸洗脱与受体竞争洗脱相结合的形式,最后从第3轮高浓度受体洗脱下的噬菌体中,随机挑选20个克隆用ELISA测定结合活性,并将强阳性信号的克隆送出测序,多个克隆在测序后得到了同一个小肽序列(T1)。将T1与GST融合,在大肠杆菌获得高表达,目的蛋白表达量占菌体总蛋白50%,用Glutathione-agarose纯化后纯度高达95%。ELISA实验进一步确证了融合表达的……   
[关键词]:BLyS_(134-285);噬菌体展示系统;短肽;mBCMA;scFv;Western blot
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:沈阳药科大学2005年