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草地早熟禾(Poa pratensis L.)抗旱耐盐基因遗传转化

信金娜

   本研究通过对草地早熟禾(Poa pratensis L.)植株再生体系的优化,建立了适合于三个品种的高频再生体系。在此基础上,通过基因枪轰击法把与抗旱、耐盐有关的外源基因(DREB1A、BADH-CMO、CMO)对草地早熟禾胚性愈伤组织进行遗传转化,经过潮霉素筛选、PCR扩增与Southern杂交检测,获得了转基因植株。同时,对部分转基因植株进行了干旱、盐碱胁迫处理,检测了转基因植株在抗旱、耐盐特性上的实际效果。通过研究,获得了以下结果: 1.通过对不同外植体诱导效果,接种方式,培养条件等因素的研究,确定了以下的愈伤组织诱导条件:以成熟种子为外植体,消毒处理后,直接接种于愈伤组织诱导培养基中黑暗培养。培养基的碳源是30mg/L蔗糖。选择致密、易碎、生长迅速的愈伤组织继代能够保持草地早熟禾的胚性,可以为遗传转化提供长期良好的植物材料。 2.通过单因素与正交试验设计,获得了适合于‘Baron’(简称B)、‘Mardona’(简称M)、‘Midnight’(简称Md)品种的完整高频再生体系。P2:MS+2,4-D(1mg/L)+6-BA(0.1mg/L)+ CuSO4(3mg/L)+CH(1g/L)为B品种的愈伤组织诱导培养基,P5:MS+2,4-D(2mg/L)+6-BA(0mg/L)+CuSO4(3mg/L)+CH(1g/L)为Md品种的愈伤组织诱导培养基,KM:MS+2,4-D(2mg/L)+6-BA(0.2mg/L)+ CuSO4(3mg/L)+CH(1g/L)为M品种的愈伤组织诱导培养基,三个品种最高胚性愈伤组织诱导率分别为38.19%、28.66%和31.67%;AK2:MS+KT(0.2mg/L)+6-BA(1mg/L)为B品种愈伤组织分化培养基,AL2:MS+6-BA(1mg/L)+LH(0.5g/L)为Md品种愈伤组织分化培养基,KBN:MS+KT(0.2mg/L)+ 6-BA(1mg/L)+NAA(0.5mg/L)为M品种愈伤组织分化培养基,三个品种最高愈伤组织分化率分别为53.33%、53.67%和60.00%。 3.在已经建立的高效再生系统基础上,通过研究不同的基因枪轰击参数,得到适合于草地早熟禾基因枪轰击的条件:采用Ca(NO3)2+PEG4000包被质粒DNA;使用1μm金粉作为质粒DNA的载体;轰击高度为6cm、轰击次数为1次、无渗透处理进行轰击效果较好。采用潮霉素(Hy)为草地早熟禾转基因植株抗生素筛选标记,Md品种愈伤组织继代的筛选浓度为130mg/L,B品种愈伤组织继代的筛选浓度为100mg/L。 4.通过采用基因枪转化法将DREB1A、BADH-CMO、CMO基因导入草地早熟禾胚性愈伤组织中,并且获得了再生植株。通过PCR、Southern分子检测,证明在B品种中获得转DREB1A基因株系13个,转双基因株系23个,转CMO基因株系6个。在Md品种中获得了转DREB1A基因株系1个,转双基因株系1个。在M品种中获得了转双基因株系2个,转CMO基因株系2个。 5.通过对部分转基因植株进行干旱、盐碱胁迫处理,对质膜透性、MDA含量、SOD……   
[关键词]:草地早熟禾;DREB1A;BADH-CMO;CMO;抗旱;耐盐
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:北京林业大学2006年