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猪传染性胃肠炎检测基因芯片与猪传染性胃肠炎病毒SC-H株N基因表达研究

黄小波

  猪传染性胃肠炎(Transmissible Gastroenteritisenteritis,TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒引起的一种高度接触性肠道传染病,临床症状主要表现为发病仔猪严重腹泻、呕吐和脱水,该病给我国养猪业造成了巨大的损失。本研究从病原学上证实了该病在四川的流行,建立了TGEV基因芯片检测新方法,进行了重要功能基因的分子生物学研究,对TGE的诊断、预防和控制具有重要意义。1 猪传染性胃肠炎病毒SC-H株的分离鉴定将腹泻病料接种到到ST细胞(猪睾丸传代细胞)上,连续盲传5代后开始出现典型的细胞病变,病变在接毒后30h开始出现,表现为:细胞肿胀、变圆、有散在堆积、最后细胞皱缩、崩解破碎,脱落。该病毒的TCID_(50)为10~(-3.92)/0.04ml、病毒能被猪传染性胃肠炎病毒阳性血清所中和,中和指数为242;透射电镜观察细胞中聚集大量的病毒粒子,病毒粒子呈球形,大小约75-90nm,病毒以胞外分泌的方式释放到细胞外;病毒对5溴脱氧尿核苷不敏感,为RNA病毒,对乙醚、氯仿敏感,对胰蛋白酶有抵抗力,pH4.0-pH8.0稳定。将分离鉴定的病毒命名为SC-H株。SC-H株的分离为该病的病原学研究、诊断和防制积累了材料。2 TGEV SC-H株主要基因的克隆与分析用RT-PCR技术扩增了猪传染性胃肠炎病毒SC-H株的S(分为S1、S2、S3、S4四段)、sM、M、N、ORF7、S′及POL基因,将扩增片段插入pMD18-T载体构建了重组质粒pMD-S1、pMD-S2、pMD-S3、pMD-S4、pMD-sM、pMD-M、pMD-N、pMD-ORF7、pMD-S′及pMD-POL,核苷酸测序结果显示S1、S2、S3、S4长度分别为1260bp、1280bp、1062bp、1217bp,序列拼接后S基因片段长4542bp;sM、M、N,ORF7、S′和POL扩增片段长度分别为378bp、852bp、1188bp、436bp、886bp及303bp。S、sM、M、N和ORF7扩增片段分别包括TGEV完整的ORF2、ORF4、ORF5、ORF6和ORF7,长度分别为4344bp、249bp、789bp、1149bp和237bp,分别编码1147、82、262、382、78个氨基酸。S、sM、M、N、ORF7编码区的核苷酸序列和其他参考毒株的核苷酸序列同源性分别在98.1-99.8%、98.1-99.7%、94.2-99.7%、98.1-99.9%及93.6-99.5%之间,氨基酸同源性在94.1-99.7%、92.7-98.8%、92.0-99.2%、95.3-99.5%及84.8-96.2%之间。进化分析显示SC-H株与Purdue株有相对较近的遗传距离。TGEV主要基因的克隆与分析为后续构建检测基因芯片和研究功能基因奠定了基础。……   
[关键词]:猪传染性胃肠炎病毒;基因克隆;基因芯片;N基因;原核表达
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:四川农业大学2006年