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沙丁胺醇单克隆抗体的制备与ELISA检测方法的初步建立

李颖

  沙丁胺醇(salbutamol,Sal),又名咳喘宁,是选择性β_2-受体激动剂的一种,能选择性激动支气管平滑肌的β_2-受体,临床上广泛用于治疗支气管哮喘。同时沙丁胺醇等β_2-兴奋剂还可作为牛、羊、禽、猪等畜禽的促生长剂,研究人员对其作用及效果也进行了深入广泛的研究,并一度将其广泛应用于畜禽生产。但由于β_2-兴奋剂易在动物脏器中积聚残留,并可通过食物链进入人体,严重危害人类健康。随着西班牙、荷兰、法国、以及中国香港、广东、北京等地相继发生食用使用β_2-兴奋剂生产的肉制品的大规模中毒事件,欧盟、美国、中国等国家和地区都先后立法禁止在畜禽生产中使用促动物生长的β_2-兴奋剂作为饲料添加剂。克仑特罗(瘦肉精)由于其营养重分配作用的深入研究和广泛应用而引起有关方面的重视,国内外均已研究出快速有效的检测方法对其进行监测,使得其非法使用受到了较有效的控制,而沙丁胺醇由于检测手段研究的相对滞后,而又与克仑特罗具有同样促生长效果,因而逐步取代克仑特罗,成为不法分子谋取经济利益的新手段。因此,建立快速、简单、方便、有效的检测手段是控制沙丁胺醇非法使用的迫切任务。本实验采用琥珀酸酐和碳二亚胺法将沙丁胺醇偶联到牛血清白蛋白和卵清白蛋白上,成为完全抗原Sal-HS-BSA和Sal-HS-OVA。纯化后进行检测,确认沙丁胺醇已经连接到蛋白质上。以Sal-HS-BSA免疫Blab/c小鼠。用间接ELISA方法检测抗体效价。当效价达到1:10000以上时,可进行细胞融合。融合的过程是在50ml灭菌离心管中进行。按一定的比例将脾细胞和骨髓瘤细胞置于离心管内,使之充分接触,按严格的剂量逐滴加入融合剂使细胞发生融合。然后加入合适的培养基,滴加到铺满饲养细胞的培养板内培养。第二天检查是否污染。一般在第6天左右,可见小克隆。当细胞长满培养板时,取细胞上清液,用间接ELISA进行阳性孔的筛选。对筛选为阳性的细胞,进行扩大培养。阳性细胞长满培养板时,采用有限稀释法进行亚克隆。经过两到三次亚克隆后,将得到的阳性细胞注入小鼠腹腔,半个月后收取腹水,测定效价。经过多次融合、筛选,得到五株阳性较强的杂交瘤细胞,命名为2A2,1D11,1D8,2F6,1F6间接ELISA效价能达到320000,160000,320000,160000,80000基本达到实验的预期目标,为进一步的实验提供了关键的物质材料。……   
[关键词]:沙丁胺醇;杂交瘤细胞;单克隆抗体;酶联免疫吸附试验
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:吉林农业大学2006年