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人参CLASSⅢ几丁质酶基因克隆、序列分析及原核表达

孙炳欣

  几丁质(β-1.4-乙酰葡萄糖胺线形同聚物)是病原真菌细胞壁的主要成分,几丁质酶通过破坏病原真菌菌丝尖端新合成的几丁质,使病原真菌细胞壁中的几丁质降解;破坏细胞新物质的沉积,致使病原体死亡,且所产生的细胞壁碎片具有诱导物作用,可激发寄主植物的抗病反应。植物几丁质酶具有广泛的生理活性,尤其在植物抗病性方面具有重要作用,植物几丁质酶基因工程成为目前抗真菌基因工程研究热点之一。本文以人参为材料,首次从中克隆了ClassⅢ几丁质酶基因,并进行了序列分析,研究了该基因在大肠杆菌中的表达情况,其主要结果如下:1.通过RT-PCR与反向PCR方法,从人参中克隆到一个ClassⅢ几丁质酶基因,并进行测序,全长为1432bp,其中包含完整的开放阅读框即从第272位的起始密码子到第1169位的终止密码子,推测编码蛋白的氨基酸序列含298个氨基酸残基,无内含子,并在GenBank上注册(DQ532359);2.人参ClassⅢ几丁质酶基因与其它植物ClassⅢ几丁质酶基因在核苷酸和氨基酸水平上有很高同源性;通过对人参ClassⅢ几丁质酶基因的系统发育树分析得出,人参ClassⅢ几丁质酶和其它植物的ClassⅢ几丁质酶具有共同的起源;Class Ⅰ、Class Ⅱ和ClassⅣ几丁质酶来源于同一祖先,而ClassⅢ与ClassⅤ几丁质酶来源于同一祖先。3.人参ClassⅢ几丁质酶基因编码一酸性几丁质酶,等电点pI为4.55,预测分子量为31.4KD;人参ClassⅢ几丁质酶氨基酸序列含有两个功能区域即N-端信号肽区和糖基水解酶18家族催化区;人参ClassⅢ几丁质酶蛋白的催化区内,144-152为几丁质酶18家族的活性位点,序列为LDGVDFDIE,活性中心为E(Glu);人参ClassⅢ几丁质酶蛋白的成熟位点在第25—26的Ala—Gly之间;4.用同源建模法模拟出人参ClassⅢ几丁质酶的空间结构模型;5.将人参ClassⅢ几丁质酶基因亚克隆到大肠杆菌的表达载体PET-28a(+)中,并转入大肠杆菌BL21中,SDS-PAGE分析初步表明几丁质酶以包涵体的形式表达。……   
[关键词]:人参;几丁质酶基因;序列分析;原核表达
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:吉林农业大学2006年