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中华绒螯蟹卵巢新基因EJO1的表达研究

陆钟岩

  第一章 中华绒螯蟹卵巢新基因EJO1和甲壳动物结构基因的研究现状中华绒螯蟹卵巢新基因EJO1系马长艳于2003年利用差减杂交技术获得的中华绒螯蟹Ⅲ期卵巢的高表达基因,该基因cDNA序列全长876 bp、编码252个氨基酸,编码蛋白质分子量大小28.18 kDa。结构基因指决定某种多肽链(蛋白质)或酶分子结构的基因。本章重点叙述甲壳动物结构基因近10年的研究进展。中华绒螯蟹卵巢是中华绒螯蟹的雌性性腺,本章叙述了近年来中华绒螯蟹卵巢在生理学、组织学和分子生物学方面的研究。第二章 中华绒螯蟹卵巢新基因EJO1在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中的表达以有EJO1基因cDNA的pMD18-T载体为模板,利用ex3591、ex3592引物进行扩增得到带BamH I和Xho I识别位点的EJO1开放阅读框,PCR产物与pMD18-T载体连接并进行BamH I和Xho I双酶切,目的片段经切胶纯化回收。将回收的EJO1基因片段插入用BamH I和Xho I双酶切的pET28b载体中,构建成表达质粒pET28b-EJO1。将构建好的原核表达质粒pET28b-EJO1转化大肠杆菌BL21(DE3),用终浓度为0.1 mmol/L的IPTG诱导融合蛋白表达,并于各不同时间点收集菌液,进行SDS-PAGE蛋白凝胶分析。结果表明,在(Mr)略大于30 kDa处有特异蛋白条带,其中诱导6小时的表达量最大,表达产物分子量与推算的融合蛋白分子量(32 kDa)相符,故初步判定为目的蛋白。经过镍离子柱亲和层析进一步纯化得到纯度较高的EJO1-HIS_6(PRO)融合蛋白。第三章 中华绒螯蟹卵巢新基因EJO1在毕氏酵母(Pichia pastoris)中的表达以有EJO1基因cDNA的pMD18-T载体为模板,利用euk1、euk2引物进行扩增,获得带Xho I和EcoR I识别位点的EJO1开放阅读框,PCR产物与pMD18-T……   
[关键词]:中华绒螯蟹;EJO1基因;原核表达;EJO1-HIS_6(PRO)融合蛋白;真核表达;EJO1-HIS_6(EUK)融合蛋白
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:南京师范大学2006年