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MAL1启动子克隆与功能分析及α-amy基因表达载体构建与分泌表达

廖昱泓

  MAL1启动子推测是个双向启动子,其中5′-3′方向的启动功能在真核生物汉氏酵母和酿酒酵母中已得到验证,而3′-5′方向是否有启动功能则没有得到证实,并且该启动子在原核生物中是否有双向启动功能也尚未知。本论文利用基因工程技术首次验证了MAL1启动子在原核生物大肠杆菌具有双向启动功能,并且证实了该启动子3′-5′方向在真核生物酿酒酵母也具有启动功能,为将它作为既可在原核生物中启动又可在真核生物中启动的新型启动子元件奠定基础。同时构建了含α-amy(α-淀粉酶)基因的酵母表达载体,得到的酵母转化子能分泌表达出α-淀粉酶活性。具体结论如下:1 本论文克隆了MAL1启动子,以Zeocin抗性基因为报告基因构建了一系列质粒,证明了这一启动子在原核生物大肠杆菌中具有双向启动功能。2 用含信号肽的西方许旺酵母α-淀粉酶基因作为报告基因,观察菌落在可溶性淀粉培养基上有无淀粉水解圈而直接筛选重组子,证明了MAL1启动子在真核生物酿酒酵母中5′-3′及3′-5′方向启动子均被葡萄糖抑制,均受蔗糖诱导。该思路避免了常用报告基因GPF基因和GUS基因,存在检测成本高且需昂贵仪器的弊端,代之以廉价的碘和淀粉,更经济也更直观,为α-淀粉酶基因作为新型报告基因奠定基础。3 对酵母转化子摇瓶培养,确定了α-淀粉酶基因分泌表达的最佳培养条件。转化子YZAho为:培养16h时,菌体浓度OD600等于1.7时,α-淀粉酶酶活力为5.53U/100μl。转化子YMAho5’为:在培养时间为24h时,加入蔗糖至终浓度为1.5%,诱导表达3 hr时,α-淀粉酶酶活力为10.73U/100μl。YMAho3’为:在培养时间为28h时加入蔗糖至终浓度为2.0%,诱导表达4h时,α-淀粉酶酶活力为9.48U/100μl。这样使西方许旺酵母α-淀粉酶不但可以做为报告基因验证启动子的功能,而且可以做为外源基因在酿酒酵母加以表达,在生产过程中具有特殊意义。……   
[关键词]:MALI双向启动子;功能;α-amy基因;酿酒酵母;分泌表达
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:贵州大学2006年