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若干抗生素的生物合成基因研究与化学合成研究

杜煜

  氨基糖苷类抗生素(Aminoglycoside antibiotics)是一类结构中既含有氨基糖苷又含有氨基环醇的抗生素,主要包括链霉素、卡那霉素、阿泊拉霉素等,绝大多数是在链霉菌属中产生的。黑暗链霉菌S.tenebrarius H6产生多种氨基糖苷类抗生素,主要有阿泊拉霉素、妥布霉素及卡那霉素B。为研究其生物合成基因,本实验室李天伯等构建了S.tenebrarius H6的基因文库,并设计探针,通过文库杂交从中得到完整基因orfE,推测为dTDP-葡萄糖-4,6-脱水酶基因。通过进一步的亚克隆和测序,我们在orfE的下游又得到一个不完整的基因orfL,推测为dTDP-葡萄糖-4-脱水鼠李糖还原酶基因,和三个完整的基因orfG1,orfG2及orfM。orfG1,orfG2和orfM分别推测为葡萄糖转移酶基因和甘露糖转移酶基因(Bankit number:476862;收录号:AY131228)。为了对orfE进行功能研究,我们进行了基因阻断实验。由于常规原生质体方法不能实现对S.tenebrarius H6的基因转移,我们在S.tenebrarius H6中建立了接合转移的基因转移系统。最终以温敏型穿梭质粒pHZ132为载体构建重组质粒,红霉素抗性基因ermE为选择标记,大肠杆菌ET12567(pUZ8002)为供体菌,S.tenebrarius H6为受体菌,在SM培养基上成功实现了接合转移,通过导入重组质粒,并在高温(42℃)、加入红霉素的选择性培养条件下与受体菌染色体发生单交换同源重组,实现orfE的基因阻断。阻断株经传代稳定性实验、游离质粒排除、PCR及PCR产物测序在基因水平确证后,发酵培养,结果发现阻断株不再产生妥布霉素。表明orfE基因是妥布霉素生物合成必须基因,与orfE连锁的基因簇可能与妥布霉素的生物合成有关。……