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精喹禾灵多克隆抗体的制备及其应用研究

曾得意

  免疫学检测技术是农药残留及其代谢衍生物和其它小分子的重要分析方法。本论文开展了精喹禾灵免疫学检测技术和仪器分析的研究,主要内容包括精喹禾灵半抗原的设计,人工抗原的合成,多克隆抗体制备和相应的ELISA检测方法的建立,同时还对水和土壤中精喹禾灵的农药残留进行了检测。1.为了得到新型特异性抗体,以精喹禾灵水解产物精喹禾灵酸为半抗原,通过质谱、核磁共振和红外分析,成功合成了半抗原精喹禾灵酸。半抗原与载体蛋白进行偶联,分别合成了免疫原(混合酸酐法(MAR))和包被原(活泼酯法(EDC或称碳二亚胺法)),紫外全扫描证实成功地合成了免疫和包被所需的人工抗原。并计算人工抗原的偶联比分别为Hapten-BSA是29.23,Hapten-OVA是7.87。2.用Hapten-BSA作为免疫原免疫3只新西兰大白兔(M4736、M4740和M4743),获得了抗精喹禾灵的特异性抗体,所得到的效价分别为1/80000、1/1280000、1/800000。因为M4743的效价最高,因此选用效价为1/800,000的血清M4743进行实验;经方阵点滴和间接非竞争ELISA确定了血清M4743的工作浓度,M4743兔子抗血清的ELISA的最适工作浓度:包被原稀释度为1/5,000(Hapten-OVA,2.05μg/mL),血清稀释度为1/200,000,此工作浓度用于ELISA方法。通过研究包被介质、有机溶剂种类与含量、缓冲液离子强度等对抗原抗体反应的亲和力和分析灵敏度的影响,优化了ELISA分析条件。在优化的工作条件下,用M4743血清建立的IC-ELISA,所得的抑制率曲线方程为I=31.793LogC+96.314,r=0.994,对精喹禾灵的抑制中浓度(IC_(50))为0.03495μg/mL,最低检测浓度为0.00192μg/mL,检测范围为0.002-0.5μg/mL。在交叉反应实验中,与其结构相似的物质没有交叉反应。3.对水和土壤的精喹禾灵残留进行分析,采用气相色谱法(GC-NPD)测定,精喹禾灵的保留时间在14.235min,方法的线性范围为0.04-1mg/L,线性方程为Y=4.0223x+0.1443,线性相关系数r为0.9995,最低检出限为0.003mg/kg,符合残留分析要求。在水样和土壤中分别添加0-1μg/mL的精喹禾灵,经IC-ELISA(M4743)和气相色谱(GC)分析检测,水样中精喹禾灵的添加回收率为分别为89.02-108.88%和90.9-115.0%,土样样中精喹禾灵的添加回收率为分别为78.95-112.75%和84.0-104.5%。两种方法的添加回收率均大于78.9%,而且分析结果的相关性好,水样和土壤中添加回收率的ELISA和GC的相关性方程:水样中R~2=0.9977,Y=0.9197X+0.0218;土壤中R~2=0.9936,Y=1.1395X-0.009。以上结果表明,制备的精喹禾灵抗体适用于对水样和土壤中精喹禾灵农药残留进行快速……   
[关键词]:精喹禾灵;半抗原;合成;多克隆抗体;ELISA;GC-NPD;;土壤
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:贵州大学2006年