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百日草链格孢菌毒素的生产、分离、纯化和鉴定及其作为微生物源除草剂潜力的研究

李荣金

  百日草链格孢菌(Alternaria zinniae)是世界恶性杂草苍耳(Xanthium sibiricum)的自然致病菌,其产生的除草活性物(毒素)对苍耳(Xanthium sibiricum)、紫茎泽兰(Eupatoriun adenophorum)、加拿大一枝黄花(Solidago canadensis)、小飞蓬(Conyza canadensis)等菊科杂草及其它农田、园林和草坪杂草具有致病活性。本文以该菌为研究对象探索了该致病毒素的深层发酵培养条件、大批量生产、化学提取工艺、致病机理,并对其作为微生物源除草剂的开发应用潜力进行了评价;通过现代有机分析技术提取纯化出了百日草链格孢菌毒素的化合物单体并确定了该毒素的化学结构。研究了不同碳源、氮源以及环境培养条件对百日草链格孢菌液体深层培养的影响。应用正交试验确定了碳源、氮源最优水平组合为A_4B_3D_4E_1;确定了有利于该菌产毒的温度为25℃、pH值为6.5、培养时间为9~12天、以及黑暗与光照、溶氧、转速、体积等培养条件并对培养基进行了改良;流加C、N源可以在优化发酵促进产毒的同时降低原料用量。并利用20L自动发酵罐对放大深层发酵实践进行了初步探索。利用直接萃取法、大孔吸附树脂浓缩提取法、大孔吸附树脂浓缩+有机溶剂萃取法等3种方法,并以石油醚、1,2-二氯乙烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、乙醚等6种极性不同的溶剂提取百日草链格孢菌粗毒素,研究结果表明,大孔吸附树脂浓缩+有机溶剂萃取法较理想,正丁醇提取效率最高,其毒素回收率可达89.7%;采取大孔吸附树脂吸附浓缩、乙醇洗脱、减压蒸馏去乙醇、乙酸乙酯萃取常压浓缩的工艺流程可达到对液体培养无菌滤液中百日草链格孢菌毒素的有效提取和初步分离。该工艺流程效率高、节约能源与时间、克服了常规浓缩方法的缺点、浓缩体积下的常压蒸馏节约了工艺操作时间,在溶剂可回收利用、浪费少、毒素提取效率等方面的优点显示了它的生产可操作性和极高的生产利用价值。对菌丝和培养液进行萃取,结果表明,百日草链格孢菌产生的毒素是分泌于培养液中的,属于胞外毒素;通过分析贮存时间、温度、光照对粗毒素稳定性的影响,表明贮存时间、温度、光照对毒素稳定性影响很小,具有开发微生物源化学除草剂之潜力。利用三次经典硅胶柱层析和HPLC、两步TLC多次制备得到对紫茎泽兰有致病性的毒素单体。百日草链格孢菌毒素化学结构鉴定按照常规有机化合物鉴定方法进行。首先……   
[关键词]:百日草链格孢菌;毒素;深层发酵;批量生产;提取工艺;分离纯化;结构鉴定
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:南京农业大学2005年