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红树林可培养微生物活性评价和土壤宏基因组文库构建及生物活性筛选

刘峰

   从深圳福田红树林保护区采集五种红树植物的叶、花、果、根、皮、根际土壤共26个样品,运用微生物纯培养技术研究了红树林环境可培养细菌、真菌和放线菌的多样性,分析了土壤含水量、盐度、pH值、有机质、P、K含量等对土壤可培养微生物(细菌、真菌、放线菌)数量的影响。通过检测分离菌株的抗肿瘤、抗白色念珠菌、抗金黄色葡萄球菌的活性,分析不同红树林样品可培养的拮抗细菌、拮抗真菌、拮抗放线菌的微生物多样性,为红树林环境微生物资源的利用提供参考依据。 从深圳红树林保护区不同红树树种根际土壤混合样品及湛江红树林混合样品提取总DNA,利用表达载体pBluescript SK+构建宏基因组文库,构建了一个包含5280个克隆子的宏基因组文库,文库外源DNA总容量约为15.5Mb,平均插入片段3.2Kb。根据外源基因赋予宿主细胞的新性状对文库进行生物活性筛选。利用高通量的酶标仪法和传统的琼脂挖块法测定抗细菌(金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus)、抗真菌(白色念珠菌Candida abbicans)活性,利用MTT法测定细胞毒(小鼠黑色素瘤B16细胞)活性。得到12个抗白色念珠菌的中强活性克隆子,其中从深圳样品中得到10个,从湛江样品中得到2个,活性克隆子所占比例分别为0.298%和0.104%,其中深圳样品土壤DNA经Sau 3AⅠ酶切所构建的文库得到3个活性克隆子,经Bam HⅠ和EcoRⅠ双酶切构建的文库得到7个活性克隆子;湛江样品土壤DNA经Sau 3AⅠ酶切和经Bam HⅠ和EcoRⅠ双酶切所构建的文库得到活性克隆子均为1个。两个不同地区的红树林根际土壤DNA用相同的方法构建的文库筛选的抗白色念珠菌(Candida abbicans)活性克隆子的比例不同。从湛江样品中得到一个细胞毒(小鼠黑色素瘤B16细胞)活性克隆子。 测定了2个抗白色念珠菌(Candida abbicans)活性克隆子的外源插入片段序列,在GenBank中比对,发现和这两个克隆子最相似的GeneBank序列中,相似率最高只有50.1%和38.2%,都是一段未知的新的序列。……   
[关键词]:红树林环境微生物;宏基因组文库;生物活性
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:华南热带农业大学2006年