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鸡白细胞介素2基因与鸡毒支原体H3株TM-1基因的串联及原核表达

郭志刚

   为了提高鸡毒支原体DNA疫苗的免疫效果,本研究运用分子克隆技术,获得了鸡白细胞介素2基因,然后将其与鸡毒支原体H3株TM-1基因进行串联构建了融合基因,并在原核细胞中进行了表达。 首先,根据GenBank中已登录的鸡白细胞介素2 cDNA序列以及原核表达质粒pET-30a的多克隆位点,自行设计引物,为了便于基因的克隆和表达,我们在引物的5’端和3’端设计了相应的酶切位点、保护位点、连接臂、起始密码和终止密码。应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从经ConA诱导培养6h的鸡脾淋巴细胞中扩增获得了大小约为460bp的DNA片段,将其连接到pMD19-T质粒上,经蓝白斑筛选、质粒PCR和双酶切鉴定后,筛选获得阳性重组克隆pMD19-T-IL-2。核苷酸序列测定分析表明,与GenBank中登录的鸡白细胞介素2 cDNA序列一致,这表明已成功克隆了鸡白细胞介素2基因。 其次,运用DNA重组技术将鸡白细胞介素2基因和鸡毒支原体H3株TM-1基因进行串联,插入到pET-30a质粒的EcoRⅠ和Hind III多克隆位点之间,经质粒PCR鉴定、双酶切鉴定和序列测定,结果表明已成功构建了含鸡毒支原体H3株TM-1基因和鸡白细胞介素2基因的融合基因,并将含有此融合基因的重组质粒命名为pET-30a-TM-1-IL-2。 最后,将此重组质粒转化E.coli BL21(DE3)菌株。经IPTG 37℃诱导表达4h后,SDS-PAGE电泳结果显示,融合蛋白得到了表达,分子量约为43kDa,主要以包涵体形式存在。表达产物在尿素存在下经超声波处理,获得了纯化的融合蛋白。这为为进一步研究鸡白细胞介素2及鸡毒支原体的生物学活性奠定了基础。 综上所述,本研究成功地构建了含鸡毒支原体H3株TM-1基因和鸡白细胞介素2基因的重组表达质粒,并将其导入原核细胞进行了表达。这为进一步研究鸡毒支原体DNA疫苗奠定了实验基础。……   
[关键词]:鸡毒支原体;白细胞介素2;融合基因;原核表达
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:内蒙古农业大学2006年