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重组鸡白细胞介素18生物学活性检测及其对鸡免疫影响的研究

李宏梅

   白细胞介素18(IL-18)具有广泛的生物学活性,能够促进γ-干扰素(IFN-γ)的产生,刺激淋巴细胞转化,增强NK细胞的杀伤活性,在介导细胞免疫、抵抗微生物感染方面具有重要的作用。对人和哺乳动物IL-18的研究已有许多报道。本研究室在2001年开展鸡白细胞介素18(ChIL-18)的研究,先后构建ChIL-18的重组质粒和原核表达系统、真核质粒及其表达系统,在此基础上,对纯化后的原核表达的重组鸡白细胞介素18产物进行生物学活性检测,对其在生产中的应用做了初步研究,同时对影响ChIL-18原核表达产物生物学活性的因素也进行了探讨。 实验一MTT法检测鸡脾和外周血NK细胞杀伤活性方法的建立 选取不同日龄的SPF鸡和肉鸡,通过贴壁法从血液和脾脏分离出NK细胞作为效应细胞,选择MDCC-MSB1和MDCC-MSBCU147分别作为靶细胞,二者按比例混合,孵育,利用MTT法检测靶细胞的活力反映效应细胞对靶细胞的杀伤活性,并对效靶比、作用时间进行比较,结果显示MSB-1和CU147均可作为NK细胞良好的靶细胞,但CU147更稳定;效靶比为20:1~50:1,作用时间8~16h杀伤效果稳定;50%DMF- 20%SDS混合物作为裂解液能够对结晶彻底溶解,优于其它溶解试剂如二甲基亚砜等。该方法为检测重组鸡白细胞介素18蛋白对NK细胞杀伤作用这一生物学活性奠定基础。 实验二鸡白细胞介素-18(ChIL-18)重组蛋白的生物学活性检测 对含有ChIL-18基因的质粒在大肠杆菌内进行诱导表达,经亲合层析法对表达产物进行纯化,用微量细胞病变抑制法——CEF-VSV系统,检测其对SPF鸡脾淋巴细胞诱导产生γ-干扰素(IFN-γ)的活性和其对病毒的抑制效果;用3H-TdR掺入法和MTT法分别检测其对T淋巴细胞诱导转化和NK细胞杀伤活性的作用。结果表明经诱导表达出分子量为44KD的目的蛋白(与GST融合表达),纯化后得到去除菌体蛋白的高纯度目的蛋白;生物学活性检测表明该蛋白能够诱导脾细胞产生IFN-γ,当浓度为250ng/ml时诱导IFN-γ的活性最高,可达1×106U/ml;但该蛋白不能直接抑制VSV在CEF上生长;能够刺激淋巴细胞显著增殖,浓度为250ng/ml时效果最佳;适当浓度的rChIL-18蛋白能促进NK细胞的杀伤活性,浓度为150ng/ml时,作用最强。以上结果表明,利用原核表达的重组鸡白细胞介素-18蛋白具有与天然鸡IL-18蛋白一样较广泛的生物学活性,为进一步研究它在生产中的应用奠定了基础。……   
[关键词]:重组鸡白细胞介素-18;生物学活性检测;马立克氏病;淋巴细胞转化;NK活性;原核表达
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:山东农业大学2006年