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重组大肠杆菌生产肠激酶的研究

顾玮彦

  Enterokinase(EK)是哺乳动物消化系统中最基础的丝氨酸蛋白水解酶之一,由重链和轻链组成,两条链通过一对二硫键相连。重链参与EK在消化道细胞膜上的锚定以及与胰蛋白酶的结合,轻链具有催化活性。切出的目标产品首位氨基酸完全忠实于天然蛋白,因此在基因工程制药领域已经成为融合表达时下游纯化的首选工具酶。目前市售的EK价格极其昂贵,从十二指肠组织中纯化的EK常含有其它蛋白水解酶的污染,从而限制了其广泛应用。近年来所做的尝试多是克隆与表达235个氨基酸的具有酶学活性的肠激酶轻链(EKLC)。本文成功的构建了两株牛肠激酶轻链(sBEKLC)基因工程菌(BL21(DE3)/pET39-sBEKLC1KX和BL21(DE3)/pET39-sBEKLC1SX)。根据其构建特点,考察了利用金属螯合层析法和渗透冲击法提取sBEKLC,结果显示,利用渗透冲击法得到了具有较强生物活性的sBEKLC粗酶液,而破胞后通过金属螯和层析得到的sBEKLC融合蛋白没有显示生物活性。进一步考察了IPTG、诱导温度和表达时间等条件对sBEKLC表达的影响。结果表明在优化条件下,菌株BL21(DE3)/pET39-sBEKLC1SX在IPTG为0.1mM,诱导温度为26℃,诱导培养8个小时时活性最高,BL21(DE3)/pET39-sBEKLCIKX则当IFTG为0.1mM,诱导温度为26℃,诱导培养8个小时时活性达到最高。对渗透冲击所得到的粗酶液,进行精制,得到了电泳纯度在95%以上的sBEKLC1SX。5ng EKLC经过16h能将20ug的人B防御素-4融合蛋白(TrxA-HBD4)完全切割。本文虽然利用大肠杆菌表达系统表达并得到了具有生物活性的sBEKLC,但部分表达产物以无活性的包涵体形式存在。利用产物N端携带6个连接的组氨酸与金属螯合层析介质中的镍离子的亲和性,应用Ni-NTA金属螯和层析对样品包涵体进行了纯化和复性研究。实验结果表明,在变性条件下纯化的样品在柱上不经洗脱,直接用复性液洗涤,可以使sBEKLC在得到提纯的同时实现复性。在优化条件下得到了电泳纯度为96%的具有生物活性的复性产物,其在25℃反应体系(50mM Tris-HC1,2raM CaCl_2,50mM NaCl,pH8.0)温浴30h时,取100ul浓度为0.05mg/ml的复性产物能酶切0.5ml含0.2mg/ml人防御素-4融合蛋白,酶切效率为71.2%。……   
[关键词]:肠激酶;重组表达;纯化与复性
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:浙江大学2006年