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灰葡萄孢除草活性菌株的诱变及其相关基因的差异显示

马娟

  灰葡萄孢产生的毒素具有除草活性,有望开发成微生物除草剂。本试验以灰葡萄孢BC4菌株及由其诱变得到的突变菌株为材料,比较其所产毒素的除草活性及所含除草活性物质的差异,并对调控灰葡萄孢除草活性物质产生的相关基因进行了研究,结果如下:1.以灰葡萄孢BC4为出发菌株,通过紫外线和化学诱变剂诱变分生孢子,共获得50个菌株。经种子萌发法和茎叶处理法筛选,得到所产毒素除草活性比野生菌株显著增强的3个突变菌株B1、B2、B3及除草活性几乎丧失的2个突变菌株B5、B23。2.摸索色谱条件,对各菌株产生的毒素进行HPLC分析,发现B1、B2、B3等突变菌株中各组分的含量均显著高于野生菌株,其最大吸收峰高均在野生菌株的5倍以上。而菌株B5、B23毒素中各组分含量与野生菌株相比明显下降,两者最大峰高值仅为BC4的39%和34%。遗传稳定性试验表明,供试菌株遗传稳定,连续培养8代除草活性未变化。优化HPLC条件对强除草活性毒素进行分离纯化,制备了4个组分,其中组分Ⅰ和Ⅳ对马唐及反枝苋具有很强的杀除活性。3.利用mRNA差异显示反转录技术对野生菌株BC4和部分诱变菌株进行差异显示分析。对灰葡萄孢不同菌株表达的基因差异片段进行了分离、再扩增,通过反式Northern杂交技术检测,筛选出阳性片段,进行克隆、测序和分析。本试验建立了灰葡萄孢菌株mRNA差异显示的体系,利用3种锚定引物和26种随机引物组合,展示了不同灰葡萄孢菌株基因片段表达的差异。通过强除草活性菌株与弱或无除草活性菌株间的比较,共得到81个差异片段。将差异片段回收纯化后,以相同条件及对应引物进行二次扩增,均能得到有效的扩增片段。经反式Northern杂交检测,筛选得到30个阳性片段。对其中5个差别表达基因片段进行克隆并测序,获得了长度分别为462bp、694bp、173bp、256bp和156bp的5条cDNA序列,利用Blast软件进行序列同源性分析,发现片段49与钙/钙调素依赖性蛋白激酶等具有较高的同源性。4.利用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术对前期获得的基因片段49的5′端未知序列进行扩增。根据片段49的cDNA序列,设计特异性引物,进行5′RACE反应,得到了一个1648bp的片段。与原片段序列进行拼接从而使其延长到2055bp。它与钙/钙调素依赖性蛋白激酶,TRAPP complex subunit Bet5等蛋白具有较高的相似性。……   
[关键词]:灰葡萄孢;除草活性;mRNA差异显示法;cDNA末端快速扩增
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:河北农业大学2006年