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猪细小病毒核衣壳蛋白VP2单克隆抗体的制备及双夹心ELISA方法的建立

董振杰

  用PK-15细胞培养的细小病毒病病毒(PPV)经差速离心和蔗糖密度梯度离心,纯化抗原免疫BALB/c小鼠。用由本实验室构建并保存的PPV—VP2基因的原核表达载体,经IPTG诱导融合表达出VP2基因蛋白,经SDS—PAGE检测是所要的目的蛋白,然后粗提纯的蛋白用Western-blotting检测有较好的免疫反应活性,将其作为间接ELISA的包被抗原建立间接ELISA,用来筛选融合后的杂交瘤细胞。取免疫BALB/c小鼠的脾细胞与NS。骨髓瘤细胞融合经间接ELISA筛选,3次有限稀释法克隆,获得了3株能稳定分泌抗猪细小病毒核衣壳蛋白VP2的单克隆抗体杂交瘤细胞株,命名为PPV—VP2—CC1、PPV—VP2—BD2、PPV—VP2—CD12。其中只鉴定CC1株杂交瘤,经鉴定该株杂交瘤为IgG1亚类,杂交瘤细胞的平均染色体数目为99条,杂交瘤细胞培养上清及小鼠腹水单克隆抗体的ELISA效价分别为2~5和2~11。CC1株单克隆抗体与猪繁殖-呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒均不发生交叉反应,显示良好的特异性。连续培养21代,CC1杂交瘤细胞株能稳定分泌抗体。腹水经辛酸硫酸铵纯化后,蛋白含量为2.151mg/mL。此种单克隆抗体的获得为PPV的研究、快速诊断方法的建立奠定了基础。利用CC1杂交瘤细胞株的小鼠腹水单克隆抗体和兔抗PPV IgG建立了检测PPV的多抗—待检病料—单抗—二抗的双夹心ELISA方法。经测定,兔抗PPV高免血清单克隆抗体的最适包被浓度为4.04μg/mL(1:1600倍稀释),McAb的最适工作浓度为6.45μg/mL(1:400),其检测灵敏度为215.5ng/mL。该检测方法与常见的猪的几种传染病病原无交叉反应,与病毒分离对比检查试验有较高的符合率。整个操作过程仅需4.5h(不包括包被)。双夹心ELISA的建立为生产上提供了一种更简单、快速、灵敏、应用广泛的PPV检测方法。……   
[关键词]:猪细小病病毒;间接ELISA;杂交瘤;单克隆抗体;双夹心ELISA
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:河南农业大学2006年