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禽流感病毒H9N2亚型和鸡毒霉形体HS株主要抗原性基因的克隆与表达研究

胡思顺

  禽流感病毒(AIV)和鸡毒霉形体(MG)是危害世界养禽业的主要病原,对世界养禽业造成了巨大的经济损失。近年来,禽流感在我国开始流行,特别是2004年初高致病性禽流感在我国和部分亚洲国家爆发流行,不仅造成了养禽业的巨大经济损失,而且导致人类的感染和死亡,引起了世界各国政府和普通民众的高度重视。另外,鸡毒霉形体是所有禽类呼吸道感染中的最基础的病原之一,在鸡群中感染普遍,血清学阳性率高,可经蛋传播,而且经常与其他呼吸道疾病混合感染,给畜牧业生产造成了极大的经济损失。为了养禽业的稳定发展和人类健康,必须加强这两种疾病病原的主要抗原基因的分子生物学研究,为最终控制和消灭这两种疾病打下良好的基础。本研究首先进行了禽流感病毒核蛋白(NP)、血凝素蛋白(HA)基因的克隆与表达研究。(1):采用RT-PCR方法,以AIV A/chicken/China/HSS2004(H9N2)株为材料,获得了NP基因的全长cDNA和HA基因的部分cDNA。(2):将获得的cDNA克隆入pMD18-T载体进行序列测定,测得NP基因cDNA序列长度为1525bp;HA基因cDNA序列长度为1172bp,HA切割位点附近的氨基酸组成分别是:R-S-SR↓G,切割位点附近氨基酸残基的这种组成符合低致病力毒株的分子特征。(3):与Genebank中基因序列的同源性比较分析得知,NP基因序列高度的保守性,具有型特异性,同亚型病毒间达97%,不同亚型病毒间亦达90%以上;HA基因与国内亚型病毒分离株间的同源性高达99%左右。说明国内的H9N2可能源自同一毒株。(4):构建了重组表达载体pKG-NP和pKG-HA,并在BL21 codon plus和BL21(DE3)中表达,结果pKG-NP在BL21 codon plus中获得了高效表达。SDS-PAGE和Western-blot分析表明,融合蛋白GST-NP大小约为84kD,约占菌体总蛋白的20%,能与鸡抗AIV抗体发生明显的抗原抗体反应。(5):利用十二烷基肌酸钠(SKL)方法纯化了GST-NP包涵体,并经过包涵体变性、复性、透析和包埋过程,获得了较高纯度的重组NP。本研究在前期研究工作的基础上,对一个来自鸡毒霉形体的、含有4个pMGA基因的重组质粒(MgW17)进行了亚克隆,得到了一个完整的pMGA基因(H-pMGA1.2),为更好地研究该基因产物的活性及高效表达,我们剔除了信号肽序列以及前端的跨膜疏水部分及膜内部分;将该DNA片段插入GST融合表达载体中并在BL21中进行了表达,表达产物大小约52kD,该产物为……   
[关键词]:禽流感病毒;NP;HA;鸡毒霉形体;pMGA;Western blot
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:华中农业大学2005年