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绿色荧光蛋白基因(gfp)转化柑橘及植株再生

刘歆

  柑橘是世界第一大水果。通过遗传改良方法创造优质、多抗及不同成熟期的品种类型,是我国柑橘育种研究的重点。然而柑橘属植物存在珠心胚干扰、童期长、雄雌性败育等现象,传统育种手段效率不高、进程缓慢。近年来,不断完善的转基因技术为我们提供了一种更加快速直接的育种和品种改良手段。本实验以柑橘愈伤组织和试管播种实生苗上胚轴为外植体,用根癌农杆菌介导法进行绿色荧光蛋白基因(gfp)的转化,获得14个品种的转基因材料,同时对转化程序、转化机制和外源基因表达进行了探讨与分析。一些带有GFP标记的材料已用于本课题组的细胞融合和细胞凋亡等研究。众多的转基因柑橘细胞系还为后期的遗传转化相关机制研究提供了试材和便利。主要结果如下:1)在得到的14个品种的转基因材料中,2个品种获得了再生植株,1个品种得到了试管苗,5个品种处于胚状体阶段,6个品种尚在愈伤组织阶段。2)共得到来自不同转化事件的细胞系/株系93个,将进行Southern Blot分析,研究外源基因在柑橘中的整合规律(整合位点、拷贝数)。3)温州蜜柑品种国庆一号(G_1)的转GFP基因愈伤组织荧光表达强烈且稳定,已成为本课题组细胞融合和细胞凋亡研究的一个活体工具材料。4)比较了抗生素筛选与GFP荧光筛选的精确性及其对转化进程的影响,证实GFP筛选比抗生素筛选更快速、简便、可靠,GFP标记的应用大大缩短了转化所需的工作量和时间。5)对决定柑橘愈伤组织转化效率的几个因素进行了比较与分析,表明:①转化效率的前期决定因素是农杆菌与愈伤组织细胞的互作,以下操作可使这种互作有利于转化效率达到较高水平:由继代历史不超过2年的农杆菌菌株新长出的菌液侵染生长旺盛、颗粒状明显的淡黄色愈伤组织悬浮细胞,先摇动侵染体系使二者充分接触,然后静置20min使农杆菌稳定附着在植物细胞壁上;在侵染后共培养前使愈伤组织细胞造成损伤或在共培养基中加入创伤诱导因子(如AS)均有利于农杆菌Vir基因的活化和T-DNA转移。……   
[关键词]:柑橘;绿色荧光蛋白;根癌农杆菌;遗传转化
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:华中农业大学2005年