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克伦特罗单克隆抗体制备和残留ELISA检测方法及试剂盒研究

王帅兵

  克伦特罗(CL)是一种β-兴奋剂,具有促进动物生长,提高饲料利用率,改善瘦肉率的作用。但该药排泄速率慢,易蓄积在动物组织中,引起消费者发生急性中毒,目前已被大多数国家列为禁用药。然而,CL滥用和残留问题仍然存在,灵敏、有效的残留检测方法是控制残留的基本手段。为建立更加灵敏、实用的CL快速筛选方法,开发试剂盒,有效监测动物源食品中CL残留,本研究对已有单克隆杂交瘤细胞进行选择、筛选和亚克隆,体内诱生法制备单克隆抗体。通过优化间接竞争ELISA(ciELISA)条件,制作标准曲线。猪、牛尿液调pH>8.0,经叔丁基甲醚提取后检测,肝脏用盐酸水解,再用0.5mol/LKH_2PO_4提取,过C18柱净化,用ciELISA检测,建立了猪、牛尿液和肝脏中CL残留ELISA快速检测方法。通过动物试验、与仪器方法的比对试验及与国外试剂盒的比较试验对建立的方法进行了考核。研究中建立细胞株C611 23/2 46B_3和C611 23/2 46A_5,制备C611 23/2 46B_3抗体,效价为1:64000,特异性良好,与其它药物的交叉反应性均低于10%。ciELISA最佳反应条件为:抗原包被浓度0.5μg/mL CL,抗体工作浓度1:32000,37℃竞争约60min,酶标二抗(羊抗小鼠HRP-IgG)稀释浓度1:5000。建立的标准曲线线性方程y=-25.306x+54.105(r=-0.9907),检测的线性范围为0.1~27ng/mL,IC_(50)(50%抑制浓度)平均为1.8ng/mL,最低检测限(LOD)达0.1ng/mL。猪尿、牛尿和猪肝中LOD均为0.3ng/mL,牛肝中的LOD为0.5ng/mL。猪尿和牛尿中添加CL 0.3、1、2ng/mL,回收率为63.82±13.93%~111.94±7.41%,变异系数小于20%。猪肝脏中添加CL 0.3、1、2ng/g,回收率为80.45±13.79%~98.45±16.99%,牛肝中添加CL0.5、1、2ng/g,回收率为82.58±15.88%~92.86±18.37%,变异系数均小于20%。……   
[关键词]:克伦特罗;单克隆抗体;间接竞争ELISA;;;尿液;肝脏;试剂盒
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:华中农业大学2005年