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产毒多杀性巴氏杆菌毒素toxA基因克隆、表达及表达蛋白生物学特性研究

王大鹏

  产毒多杀性巴氏杆菌(toxigenic Pasteurella multocida,T~+Pm)是猪进行性萎缩性鼻炎(Swine progressive atrophic rhinitis,PAR)的主要病原菌。该菌分泌产生的多杀性巴氏杆菌毒素(Pasteurella multocida toxin,PMT)是一种约146kDa的皮肤坏死毒素。该毒素由toxA基因编码,是T~+Pm的主要致病因子。PMT有很强的致病性,只注射少量提纯的PMT就可以复制PAR。鉴于PMT在PAR的产生过程中所起的重要作用,有关PMT的检测便成为检测PAR的关键。PMT的N端是粘附位点,C端是催化位点,中间区域为跨膜区,虽然PMT具有很强的致病性,但是部分缺失的PMT蛋白可以失去其致病性而保留免疫原性,这对于PAR疫苗的研制具有重要的意义。本研究针对T~+Pm的toxA基因及其表达产物开展了以下工作:1、参照GenBank已发表的toxA基因序列,分别设计了针对T~+Pm toxA基因及其3`端的2对寡核苷酸引物。以本实验室分离保存的T~+Pm菌株HN-13为实验材料,用PCR的方法成功扩增toxA基因的全序列及其3`端基因片段C2115。对toxA基因的PCR产物进行序列测定,结果表明:该片段共4019bp,ORF为3858bp(登陆号:AY864768);与GenBank上所报道的toxA基因序列核苷酸同源性都在99.8%以上。将扩增的基因插入原核表达载体pGEX-KG,成功构建了重组质粒pGEX-toxA。将该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经诱导获得大小约173kDa的表达蛋白(rPMT)。Western blot检测表明,表达蛋白具有良好的反应原性。动物试验表明,以表达蛋白免疫的昆明小鼠,可以抵抗天然毒素致死剂量的攻击。2、为了更好的研究毒素蛋白的生物学活性,在所克隆的toxA基因的基础上,用酶切的方法获得了5个亚克隆片段:N1518、N3172、C2345、C2693和C3388。将上述5个基因片段和3’端基因片段C2115插入pET-28a(b,c)载体系统,分别转化大肠杆菌BL21(DE3),诱导表达。结果pET28b-C2115和pET28a-N1518重组质粒获得了高效表达,分别表达了toxA5’端的1518个碱基和3’端基因的2115个碱基。表达蛋白的大小分别约57kDa(rPMT-N)和78kDa(rPMT-C),Western blot检测表明,两种表达蛋白具有良好的反应原性。3、分别以rPMT-N和rPMT-C免疫大白兔,连续免疫5次,每次间隔10d,并用琼脂双向扩散试验检测效价。结果,rPMT-N抗血清效价达1/32,rPMT-C抗血清效价达1/16。4、以rPMT-N和rPMT-C的混合物为抗原,初步建立一种检测PMT抗体的间接ELISA方法。经方阵滴定确定抗原最佳包被浓度为1.6μg/mL、血清最佳稀释倍数为1:40,阴阳性界限为OD_(630)=0.291;用该方法检测608份临床送检血清,结果表明阳性率达69.6%。……   
[关键词]:产毒多杀性巴氏杆菌;toxA;类毒素菌苗;;
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:华中农业大学2005年