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人新基因EOLA1的原核表达、蛋白纯化及多克隆抗体制备

蔡震

  脓毒症(sepsis)是多器官功能障碍(MODS)的前兆,是当前危重病医学面临的难题之一,它也是导致严重烧伤、创伤患者死亡的主要原因之一;其发病机制与内毒素(LPS)激活血管内皮细胞诱发并加重全身炎症反应密切相关。脓毒症的病理生理机制复杂,现行的治疗措施有限,因此我们深入研究其发病机制就显得尤为重要。近年来,由于血管内皮细胞是内毒素作用的直接靶细胞之一,国内外对LPS激活内皮细胞的作用途径、特异受体、胞内信号转导等方面研究较多。本研究室前期应用抑制消减杂交(SSH)和cDNA末端扩增技术(RACE),从LPS刺激后的人脐静脉内皮细胞中克隆到一个人类新基因全长cDNA序列,经Northern blot验证后作为人类新基因被GenBank全长序列库所接受(No.AY074889)。因其在受LPS刺激的内皮细胞中上调表达,故暂时命名为内皮高表达脂多糖相关因子1(endothelial-overexpressed lipopolysaccharide-associated factor 1,EOLA1)。目前,国外尚无关于该基因的相关研究,本实验室对EOLA1基因做了一些前期研究工作,并经生物信息学分析显示:该基因全长1404个bp,其定位于染色体Xq27.4,编码蛋白由158个氨基酸组成,分子量17.89kDa,等电点6.43,亲水性好,为可溶性蛋白。其二级结构含α螺旋、β片层结构和β转角,并形成一个螺旋—转角—螺旋(HTH)基序。EOLA1氨基酸序列包含N-糖基化位点、PKC磷酸化位点和酪氨酸激酶2磷酸化位点。多组织Northern blot显示EOLA1基因除在LPS刺激的内皮细胞上调表达外,在骨胳肌、心脏、肾脏、肝脏和胎盘有较强的表达,在结肠、小肠、脾脏有较弱的表达,而在脑、胸腺、肺和外周白细胞则未见表达。在7种癌细胞株上,显示在早幼粒白血病系HL-60、海拉细胞系S3、慢性骨髓性白血病系K-562和肺癌细胞系A549都有表达,而在成淋巴细胞瘤性白血病MOLT-4和结直肠腺癌SW480表达水平最高,但在黑素瘤G-361无表达。在经过G418压力筛选后的稳定表达EGFP-EOLA1(enhanced green fluorescent protein-EOLA1)融合蛋白的ECV304细胞株中发现EOLA1蛋白为全细胞分布。酵母双杂交显示EOLA1蛋白与细胞内金属硫蛋白相互作用,可能参与细……   
[关键词]:内皮高表达脂多糖相关因子1;内毒素;原核表达;包涵体;纯化;多克隆抗体
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:第三军医大学2005年