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禽传染性支气管炎病毒S1基因在毕赤酵母中表达的研究

余祖华

  本研究根据本课题组在GeneBank中注册的禽传染性支气管炎病毒中国分离株的S1基因序列(AF397527、AF397528、AF397529和AF036937)及毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K的序列设计引物,用RT-PCR方法扩增出IBV S1基因。对该基因克隆测序结果表明,IBV S1基因表达片段序列长度为1566bp,编码521个氨基酸,5’端不含信号肽序列,3’端添加了终止密码子。用限制性内切酶SnaB Ⅰ和Not Ⅰ将S1基因和载体pPIC9K酶切回收后连接,构建了S1基因的表达质粒pPIC9K-S1。用限制性内切酶BglⅡ将表达质粒pPIC9K-S1线性化,然后用电转化的方法导入毕赤酵母GS115。将在MD平板上生长的转化子经过PCR鉴定和表型筛选后,获得了整合型阳性重组菌株,命名为GS115/pPIC9K-S1 His~+Mut~s。将重组菌株在1%的甲醇中进行诱导分泌表达,通过SDS-PAGE和Western-blot对表达产物进行分析,结果表明,IBVS1基因在毕赤酵母中成功获得了表达,表达蛋白的分子量约为76KD,能与IBV阳性血清特异性结合。通过摇瓶培养初步优化了接种量、诱导剂甲醇浓度以及诱导时间等对IBV S1蛋白表达有影响的条件。SDS-PAGE分析结果表明,在2%接种量、1%甲醇诱导第3天时重组菌株目的蛋白表达量最高,占上清中总蛋白量的12.5%。表达的IBV S1蛋白可作为制备IB诊断抗原、基因工程疫苗的基础材料。本研究对IB的防治有重要理论和实用价值。……   
[关键词]:禽传染性支气管炎病毒;S1基因;毕赤酵母;分泌表达
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:四川农业大学2005年