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灰色链霉菌RX-17溶菌酶基因文库的构建及筛选

张晓东

  灰色链霉菌(Streptomyces griseus)RX-17所产的溶菌酶系,不仅具有β-1,4-N-乙酰胞壁质酶活力,还具有β-1,4-N,6-0-二乙酰胞壁质酶活力。前期研究发现本菌株产生溶菌酶含有多个组分,R1、R2和R3,对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)及变形链球菌(Streptococcus mutans Ingbritt)有溶解作用。本文采用随机鸟枪法构建基因文库,筛选溶菌酶基因,为今后溶菌酶基因组的研究奠定基础。限制性内切酶Sau3AI对灰色链霉菌(S.griseus)RX-17基因组DNA进行不完全酶切,回收2-10kb的DNA片段:回收片段与经BamHI酶切、CIAP去磷酸化处理后的pUC19连接,构建重组质粒,转化E.coli DH5 α感受态细胞;通过Amp抗性及α互补原理进行初筛,构建基因文库。灰色链霉菌(S.griseus)溶菌酶对变形链球菌(S.mutans Ingbritt)有着显著的溶解作用,因此我们用变形链球菌(S.mutans Ingbritt)作底物用酶活测定的方法对文库进行筛选。25℃低温诱导对文库进行筛选,得到两株具有酶活的重组子。破碎细胞,20号重组菌株上清液SDS-PAGE电泳检测到24kD的重组蛋白,大小与溶菌酶组份R2相同;以primerA、primerB为引物PCR扩增,在有酶活的20号重组菌株扩增出一段大小为700kb左右的PCR片段,与溶菌酶R2基因片段大小接近;证实了在随机文库中筛选到R2基因。对于重组子的筛选还可以采用PCR检测的方法。根据共用引物和R1N末端设计的引物扩增到大小约1.3kb左右基因片段。……   
[关键词]:灰色链霉菌;基因文库;重组;转化;基因扩增
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:山东大学2005年