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家蚕SCI-SB基因克隆及其原核表达的研究

张苗

  根据NCBI已经报道的SCI-SB的mRNA序列,自行设计一对特异性引物,利用RT-PCR 扩增获得 SCI-SB 的cDNA片段,将该片段连接到原核表达载体pGEX4T-1中,经PCR、酶切鉴定以及测序分析,证实成功构建了重组表达载体pGEX4T-1-SCI-SB。用已构建的重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3),挑取阳性克隆培养,IPTG 诱导后裂解菌作SDS-PAGE 分析,在34 kD处有一特异性蛋白条带,与预期值相符。表达量可达菌体总蛋白的15%左右。融合蛋白以包涵体的形式存在,超声波裂解菌体分离包涵体并离心、洗涤;用20%Sarkosyl(十二烷基肌氨酸钠)溶解包涵体,采用亲和层析纯化了融合蛋白GST-SCI-SB。胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶活性抑制实验表明,该融合蛋白具有一定的胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶活性抑制作用。质谱分析表明,与rSCI-SB期望氨基酸序列基本一致,。以该融合蛋白为抗原免疫两只雄性新西兰大白兔制作了该重组蛋白的多克隆抗体,ELISA检测该抗体血清的效价可达到1.56x10~-4(1:6400)以上。Western印迹实验呈阳性,进一步证实了重组蛋白的表达。……   
[关键词]:家蚕;SCI-SB基因;原核表达;胰凝乳蛋白酶抑制剂;多克隆抗体
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:浙江大学2005年