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盐酸克伦特罗单克隆抗体制备及其免疫层析试纸条的研制

陈小旋

  盐酸克伦特罗(Clenbuterol hydrochloride)又称为“瘦肉精”、“营养重分配剂”,是一种人工合成的β-肾上腺素受体激动剂。该药物是最广泛使用的支气管扩张剂,用于人类和动物的哮喘疾病的治疗。另一方面,它具有促进动物生长、增加肌肉含量、降低胭体脂肪蓄积、提高瘦肉率的作用,曾被作为饲料添加剂广泛地应用于畜牧业生产。由于克伦特罗可残留在人和动物体内并造成中毒,因此已在世界范围内禁用。目前对非法使用的克伦特罗(CL)的检测主要依赖于色谱技术和免疫分析技术。这两种方法需要专业人员操作,操作复杂,费时,成本比较高,不便于在屠宰现场检测。本实验利用杂交瘤技术制备了3株可分泌盐酸克伦特罗抗体的单克隆抗体,对其进行纯化鉴定;在此基础上建立了克伦特罗金标检测试纸条,从而达到快速、简单、方便检测克伦特罗的目的。首先利用重氮法将CL和卵清白蛋白OVA、牛血清白蛋白BSA偶联产生免疫抗原BSA-CL和包被抗原OVA-CL。通过紫外扫描和蛋白电泳分析鉴定,发现偶联前后载体蛋白OVA、BSA的吸收峰发生改变,电泳结果显示偶联物的分子量大于载体蛋白的分子量,初步判定偶联成功。以BSA-CL免疫Balb/C小鼠。三免后,以OVA-CL包被酶标板,用间接非竞争ELISA法检测小鼠血清,血清效价最高达1:1600。四免后取效价最高的小鼠的脾脏细胞,利用50%PEG1000将其与SP2/0细胞进行细胞融合,制备杂交瘤细胞。经过对培养上清的筛选和杂交瘤细胞的克隆化,最终得到3株能分泌盐酸克伦特罗抗体的杂交瘤细胞株:CL1-A3、CL2-C9和CLA-D8。用扩大培养所得的杂交瘤细胞诱导小鼠产生腹水,其效价分别为1.56x10~(-5)、7.8×10~(-6)和6.25x10~(-5)。经双向免疫扩散实验鉴定,3株单克隆抗体蛋白均为IgG,其亚类型为IgCl。辛酸-硫酸铵沉淀法纯化单抗腹水后,测得其蛋白含量分别为3.51mg/mL、6.50mg/mL和5.57mg/mL。用SDS-PAGE进行抗体纯度鉴定,电泳图谱均显示了IgG抗体及其重链和轻链条带,分离的抗体纯度在90%以上。选取其中纯化的单抗CL2-C9进行间接ELISA实验,结果表明其最小检出限为0.01mg/kg。将CL2-C9和结构类似物沙丁胺醇进行交叉反应实验,二者的交叉反应率为2.5%,说……   
[关键词]:盐酸克伦特罗;ELISA;单克隆抗体;胶体金;免疫层析
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:福建农林大学2005年