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SARS-CoV S1蛋白在哺乳动物细胞的表达和纯化

谭洁琼

  目的:引起严重急性呼吸综合症(severe acute respiratory snydrome,SARS)的病原体SARS冠状病毒是一种新型的冠状病毒。Spike(S)蛋白为Ⅰ型跨膜蛋白,是SARS冠状病毒表面的最重要的膜蛋白,具有与受体结合的功能和促进病毒与细胞膜融合的作用,它与病毒的致病性及组织亲嗜性密切相关,可能是病毒诱发机体免疫系统生成中和抗体的主要抗原蛋白。S蛋白可以分为两个结构域:S1和S2。S1蛋白上存在与受体结合的位点,S2与病毒外壳膜和宿主细胞膜的融合有关。本研究的目的在于构建能在真核细胞中高量表达的S1重组融合蛋白质粒。并在哺乳动物细胞中表达,再加以纯化获得具有生物活性的重组融合蛋白。为SARS机理探讨和疫苗研究奠定实验基础。方法:利用自行设计的引物,以包含全长SARS-CoV S蛋白基因的质粒(PUC18 S)为模板进行PCR反应,扩增出SARS-CoV S1蛋白基因序列,与分泌序列CD5L和人IgG FC段一起连接到真核表达载体pEAK12中。构建能在哺乳动物细胞中表达出带有人IgG FC标签的S1融合蛋白的质粒。将构建成功的质粒转染293E细胞,通过嘌呤霉素药物筛选出整合到细胞基因组,得到能高量表达S1融合蛋白的细胞株。经western blotting鉴定蛋白,纯化SARS-CoV S1融合蛋白,用流式细胞技术鉴定了其生物活性。结果:构建出的真核表达质粒,经酶切和测序鉴定后,插入片断准确无误。并筛选出稳定表达分泌型SARS-CoV S1融合蛋白的细胞株。经纯化出的SARS-CoV S1融合蛋白能很好的与含有SARS-CoV S蛋白受体的VerE6细胞相结合。结论:成功构建出SARS-CoV S1融合蛋白的真核表达质粒;筛选出高量表达分泌型SARS-CoV S1融合蛋白的细胞株;纯化得到具有良好生物学活性的重组SARS-CoV S1融合蛋白。为重组蛋白疫苗的生产奠定了基础。……   
[关键词]:严重急性呼吸综合症;冠状病毒;疫苗;真核表达质粒;蛋白纯化
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:南华大学2005年