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利用基因芯片技术筛选敌敌畏中毒脑损伤的相关基因

赵赞梅

  目的:从急性敌敌畏中毒导致脑损伤的模型大鼠和正常大鼠的海马组织中提取总RNA,与构建的敌敌畏中毒脑损伤相关基因表达谱芯片进行杂交,找出差异表达基因,从分子水平探讨有机磷中毒致脑损伤的机制,为临床救治提供线索。方法:实验采用以核酸杂交为基础的基因芯片技术寻找差异表达基因。从中外文献中查找大鼠海马中与抽搐、神经毒素中毒有关的基因,在基因库(Genebank)中找出其mRNA序列,用探针设计软件处理这些基因序列,比对核苷酸序列(Nucleotide blast)从中找出符合基因芯片探针条件的mRNA片段作为寡核苷酸探针。用合成仪合成探针,并与点样液等比例混匀后用点样仪将探针按一定顺序点在醛基修饰的玻璃片上制成寡核苷酸芯片。每次取体重160-200g的Wistar大鼠4只,雌雄各半,随机分为2组,即实验组和对照组,实验组大鼠按照13mg/kg的剂量皮下注射敌敌畏标准品,对照组皮下注射相同体积的生理盐水。中毒大鼠发生强直痉挛性抽搐20分钟后断头活杀,对照组在相应时间点活杀,分别取海马组织,提取总RNA。反转录并荧光标记后与构建的芯片进行杂交。杂交后的芯片经过洗涤、晾干后用扫描仪进行扫描,对获取的图像信息进行分析,寻找出表达水平发生了变化的基因,并对其功能进行分析。从差异表达基因中挑选两条进行逆转录-聚合酶链式反应扩增,将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,观察所选基因在实验组和对照组中的表达有无差异,表达变化的情况和基因芯片的结果是否一致,从而对基因芯片的结果进行验证。结果:实验组大鼠都能在给药后3-5分钟发生强直痉挛性抽搐,并能持续存活20分钟以上,成功的建立了急性敌敌畏中毒大鼠模型。电泳结果和紫外分光光度计检测的结果表明,从大鼠海马中抽提的总RNA,无论实验组还是对照组,其完整性和纯度都是符合实验要求的。依据文献报道,找出了40条表达可能发生变化的基因探针,将2条水稻基因探针作为阴性对照,和5条大鼠看家基因探针共同构成包含50条探针的基因芯片。将总RNA反转录成cDNA并用双色荧光标记后与……   
[关键词]:基因芯片;敌敌畏中毒;差异表达基因;中枢神经系统
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:中国人民解放军军事医学科学院2005年