手机知网 App
24小时专家级知识服务
打 开
手机知网|搜索

节瘤拟杆菌早期鉴别诊断—PCR检测方法的建立与应用

邵西群

  腐蹄病是危害反刍动物养殖业发展的重要疾病之一,瘤拟杆菌(D.nodosus)是引起牛、羊、鹿等反刍动物腐蹄病的原发性病原菌,为指导疫苗预防需要建立D.nodosus的早期鉴别诊断技术。本研究根据节瘤拟杆菌特有保守序列设计引物,利用聚合酶链式反应(PCR)建立了一种简单区分该菌菌群的检测方法。(1)比对纤毛蛋白基因相关序列,依据Ⅰ,Ⅱ菌群的保守序列,设计了可区分两大菌群的三条引物,其中上游引物共用,下游引物分别对两大菌群特异。(2)对可能影响PCR反应的一系列因素进行了较详细的研究,选择了适宜PCR反应的快捷处理病样及血样获得反应模板的方法:病样离心分离细菌,2TE—1%TritonX—100煮沸裂解细菌,离心取上清作模板;用EDTA抗凝血样,温和裂解红细胞,离心沉淀细菌,以后操作同病样处理。对PCR反应条件进行了优化:选3个因素Mg~(2+)、引物、Taq酶,各3个水平,9个反应组合,选出最佳反应条件,95℃2分钟;94℃35秒,60℃30~40秒,70℃30~35秒,35个循环:70℃5分钟。25ul,30ul,50ul反应体系:MgSO_40.2—0.25mM,引物0.2—0.3um,Taq酶1.5—1.75U(50ul体系),1U(30ul体系),0.8U(25ul体系),PCR反应体系用带有(NH_4)_2SO_4的反应缓冲液。灵敏度最高可检测30个菌/30ul反应体系。(3)验证引物特异性试验:设计用鹿、牛、羊等健康群体的环境存在菌(鲜粪,圈泥及其MEB厌氧,有氧培养物)制备模板扩增,用鹿、牛、羊等健康血样制备基因组核酸作模板扩增,及以上模板同时掺入已知节瘤拟杆菌基因组核酸,观察到掺入的扩增阳性,未掺入的直接用上述模板扩增阴性,重复实验,结果一致,证明引物对节瘤拟杆菌是特异的。(4)PCR方法用于病样的检测,共有16个临床病样扩增阳性,其余样品扩增阴性,重复PCR实验,扩增结果一致。向阴性反应体系掺入节瘤拟杆菌基因组核酸,掺入扩增阳性;20份临床病样中13份直接PCR阳性,病样培养物PCR阳性11例与病样直接PCR阳性结果吻合;病样涂片镜检疑有D.nodosus病样11例与病样直接PCR阳性结果吻合,表明PCR方法检出符合率高。临床病样检测发现采自趾叉皮炎的16份病样与病样直接PCR检测阳性吻合,趾叉皮炎是腐蹄病的初期感染症状,表明PCR检测方法适宜腐蹄病的早期诊断;用病样对应血清与纤毛抗原琼扩实验,健康动物存在该菌的抗体,表明通过检测血清抗体间接确定抗原的血清学方法受抗体产生消退延迟影响不能区分曾经感染和当前感染的菌型。此外发现制约PCR直接检测临床病样的限制因素是病样中细菌外的抑制物,采样部位及病样处理直接影响PCR对目标菌的检出率。为进一步验证扩增条带为目标菌序列片段,采用PCR特异扩增条带测序验证,节瘤拟杆菌扩增产物和病样扩增阳性产物测序显示,扩增产物序列一致。在保证病原采集质量,防止实验操作中交叉污染情况下,本实验建立的PCR检测方法,一次实验还可区分Ⅰ、Ⅱ血清群。可实现对临床初期感染病样中节瘤拟杆菌快速、灵敏、准确的直接检测。……   
[关键词]:节瘤拟杆菌;PCR早期诊断;腐蹄病
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:中国农业科学院2005年