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长白猪IFN-γ基因的克隆、序列分析、原核高效表达及其抗病毒活性的测定

赵英杰

  根据Vandenbroeck.K 等发表的猪IFN-γ基因序列设计并合成引物,以经ConA 诱导的长白猪外周血淋巴细胞提取的总RNA 为模板,用RT-PCR 方法扩增出长度为536bp 的目的基因片段。将该基因克隆到pGEM-T 载体上,经序列测定,结果表明获得了长白猪IFN-γ基因的克隆。该基因包含长白猪IFN-γ基因的全长为501 个碱基的开放阅读框,编码166 个氨基酸组成的功能蛋白。序列分析表明:该基因与GeneBank上收录的猪IFN-γ基因以及我国地方猪品系藏猪、成华猪IFN-γ基因在核苷酸序列和编码氨基酸上完全一致。对长白猪IFN-γ基因进行亚克隆,构建了长白猪IFN-γ基因的原核表达载体pET28b -PoIFN-γ。经酶切、PCR 鉴定,表明所构建的重组质粒为特异性长白猪IFN-γ基因原核表达质粒。将该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞,阳性菌落筛选、SDS-PAGE 分析以及Western blot分析表明,成功构建了表达重组猪IFN-γ的大肠杆菌基因工程菌株。分别以IPTG 和乳糖作为诱导剂对基因工程菌株进行诱导。结果显示,在分子量约为22.8 kDa 处有明显的蛋白质表达条带,与预期的融合猪IFN-γ成熟蛋白大小一致。IPTG 和乳糖的诱导表达效果差异不明显。证实基因工程菌株BL21(DE3)/pET28b-PoIFN-γ能够高效表达猪IFN-γ融合蛋白。表达的融合蛋白主要以不溶性包涵体形式存在,约占菌体总蛋白的53.6%。通过对猪IFN-γ原核表达产物的提取和纯化获得了纯度较高的活性蛋白,纯化和复性后的纯度分别达84.4%和87.3%。采用微量细胞病变抑制法测定了重组长白猪IFN-γ的抗PEDV 和TGEV 活性。结果显示纯化样品有较强的体外抗猪腹泻病毒活性,抗TGEV 和PEDV 的比活性分别为1.1×107U/mg 和2.8×107U/mg。……   
[关键词]:长白猪;IFN-γ;克隆;序列分析;原核表达;活性测定
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:吉林大学2005年