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植物激活蛋白的分离纯化与活性检测

仲新华

  从真菌(Alternaria app strain)中提取的植物激活蛋白是一种高效、多功能、广谱性、无污染的能诱导植物对病虫害产生免疫抗性的新型植物诱导物质。本论文对植物激活蛋白进行了纯化分离,通过实验优化,探索并建立一套适合本实验室的植物激活蛋白的纯化方法,并对纯化后的植物激活蛋白处理的接种番茄灰霉病菌的番茄幼苗中三种主要防御酶POD、PPO、CAT 活性、H2O2 水平和POD 同工酶的动态变化进行了研究,为植物激活蛋白作用机制的阐明及适时、适量的田间应用提供理论指导并为下一步的蛋白质结晶和基因克隆打下基础。结果如下: 1. 植物激活蛋白的纯化。42KD 植物激活蛋白的纯化程序是:先用10~20%饱和度硫酸铵进行分级沉淀,上HitrapTM 26/10脱盐柱脱盐后,依次进行HitrapTM Q FF 阴离子交换层析和SephacrylS-100 凝胶过滤层析,平衡液为醋酸缓冲液(pH4.0),以含0.15~0.20mol/L KCl 的醋酸缓冲液(pH4.0)进行梯度洗脱,两次层析的流速均为1ml/min。经过上述步骤,最终经SDS-PAGE 检测为42KD 单一条带。测得42KD 植物激活蛋白的等电点为3.06,是一种酸性蛋白。42kD 植物激活蛋白前面8 个氨基酸残基序列为:ALHHAPEG××××××,将其与GenBank 中的氨基酸序列检索比较后没有发现同源序列,为一新的氨基酸序列。2. 植物激活蛋白对番茄叶片中主要防御酶酶活性的影响:(1)1μg·ml-1、2μg·ml-1、4μg·ml-1的植物激活蛋白对抗、感番茄幼苗中POD、PPO、CAT 均具有诱导作用,且POD、PPO 两种防御酶的变化趋势相似。而CAT 活性被植物激活蛋白明显抑制,从而增加植物体内H2O2 含量(2)2μg·ml-1的植物激活蛋白对POD、PPO、CAT 的对抗、感番茄品种诱导效果较好,(3)植物激活蛋白对番茄与番茄灰霉病菌互作中POD、PPO 具有相似的诱导效果。经植物激活蛋白处理后,番茄主要防御酶POD、PPO 活性均比空白对照高,表明植物激活蛋白可诱导和增强POD、PPO 的表达,从而增强植物的防御反应。(4)水杨酸(SA)处理后CAT,H2O2的变化与植物激活蛋白相似。(5)处理后第5 天进行灰霉病菌挑战接种表现较强的系统抗性,防治效果达到71.30%。(6)POD 同工酶谱带变化:当用2μg·ml-1 的植物激活蛋白和0.01%SA 处理后,中蔬6 号与空白对照相比,b1,b2 带加强,0.01%SA处理出现了a1,a2两条新的条带。在与灰霉病互作中,a2,a3,b2条带明显增强,同时也出现了a1新的条带。说明植物激活蛋白可诱导或增强b1、b2、a1、a2、a3带POD 同工酶谱带的表达。……   
[关键词]:植物激活蛋白;蛋白纯化;防御酶;系统诱导
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:新疆农业大学2005年