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鸡IFN-γ基因的克隆与原核表达

鲍鸣

  干扰素(Interferon,IFN)是一类具有抗病毒和免疫调节等作用的细胞因子。其中,Ⅱ型干扰素(又称作 IFN-γ)是在抗原或有丝分裂原的刺激下,主要由活化的 T淋巴细胞及 NK 细胞所产生,它影响机体的细胞免疫和体液免疫反应。鸡 IFN-γ是 1995年由 Lowenthal 等发现的,同年 Digby 等首次克隆出鸡 IFN-γ基因,并在大肠杆菌中进行了表达。为了了解鸡 IFN-γ在抗病毒免疫应答中的作用及其机理,本研究进行了该基因的克隆、表达和鉴定。 首先,根据 GenBank 已登录的鸡 IFN-γ序列,应用 Primer Premier 5.0 软件设计了一对引物,应用反转录-聚合酶链式反应(Reverse transcription-polymerase chainreaction,RT-PCR)技术,从经刀豆素 A(Concanavalin A,ConA)诱导活化的鸡脾淋巴细胞总 RNA 中扩增得到一条特异性基因片段,其大小约为 500bp。PCR 产物分离纯化后将其克隆到原核表达载体 pGEX-4T-1 上,经质粒 PCR 和 EcoRI、SalI 双酶切鉴定,筛选出阳性重组克隆后进行序列测定。 其次,对该序列及多种动物的 IFN-γ运用计算机序列分析软件进行核苷酸和氨基酸序列的比较分析和遗传进化分析。序列结果分析表明,克隆的鸡 IFN-γ(Chickeninterferon-gamma,ChIFN-γ)开放阅读框由 495bp 组成,编码 164 个氨基酸的前体蛋白,成熟蛋白由 145 个氨基酸组成,与 GenBank 中报道的鸡 IFN-γ基因序列完全一致,与鸡形目的火鸡、环颈雉、日本鹌鹑及盔珠鸡相比,核苷酸水平的同源性为 96.8%、95.6%、95.6%和 93.5%,氨基酸水平的同源性为 97.0%、97.0%、93.3%和 87.3%。而与鸭、鹅的 IFN-γ序列进行同源性比较,在核苷酸水平分别为 80.6%和 81.8%,氨基酸水平分别为 66.7%和 67.9%。ChIFN-γ与哺乳动物的 IFN-γ基因序列同源性在 27.1%~39.6%,氨基酸序列同源性在 24.2%~29.7%之间。基因进化树和氨基酸进化树分析表明:本研究所克隆的 ChIFN-γ序列,无论从核苷酸水平还是氨基酸水平,与鸡形目和哺乳类动物的 IFN-γ序列的进化关系均比鸡Ⅰ型干扰素近,同时经抗原性比较分析,鸡形目下 IFN-γ的抗原性有较高的相似性。 最后,将重组表达质粒 pGEX-4T-1-IFN-γ转化大肠杆菌 BL21 菌,经 37℃和1.0mmol/L IPTG 的诱导表达,SDS-PAGE 凝胶电泳表明该基因在大肠杆菌中得到高效表达,且表达产物主要以包涵体的形式存在。融合蛋白的分子量约为 43kD,与预期结果相符。 综上所述,本研究成功地克隆了鸡 IFN-γ基因,构建原核表达质粒,并进行了原核蛋白的表达。本研究为了解各物种间干扰素序列的进化关系提供理论依据,同时也为进一步研究鸡 IFN-γ重组蛋白的免疫学特性和生物学活性及其应用奠定基础。……   
[关键词]:;IFN-γ;基因克隆;表达
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:安徽农业大学2005年