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用分子标记鉴定转Bt基因棉和检测纯度的技术研究

张丽

  本研究以当前生产上广泛使用的 4 个棉花品种为试材,在 DNA 快速提取方法、PCR反应体系、RAPD 检测技术体系和 SSR 检测技术体系四个方面进行了研究,探讨了利用分子标记进行转 Bt 基因棉的品种鉴定和纯度检测技术,并与传统的卡那霉素法相比较,为转基因抗虫棉种子快速检测提供了依据。通过研究,得到如下结果:1.卡那霉素法检测与 PCR 技术检测结果比较 用卡那霉素对转基因棉花中棉所41和国抗一号检测,检测结果分别为89%和86%。与用 PCR 技术检测结果进行比较,发现二者结果趋势一致,但卡那霉素的检测结果偏低。与 PCR 技术相比,卡那霉素法存在周期较长、比较费工、易受环境影响等缺点。用 PCR 技术进行品种鉴定,简便、快速、灵敏度高,需要的样品量少,检测不受时间、取样部位限制,且结果可靠。2.建立了快速提取 DNA 的方法 本实验直接在常温下提取种子 DNA,获得了较好结果,这与前人的做法有很大区别。由于以转基因植物检测为目的,对 DNA 质量要求不高,因此去除了繁杂的纯化步骤,得到了理想效果。DNA 提取液仅仅加入了 SDS,没有 EDTA 和巯基乙醇等物质,提取液配制大大简化。具体程序如下:①将种子去皮砸碎,加入 10 倍(μl /mg)的预热(70℃)提取液(200mM Tris-HCl, PH=8.0,1.5% SDS)。②70℃水浴提取 10min,取出后立即加入等体积的酚:氯仿,8000rpm 离心 10 分钟。③取上清液 lμl,用作 PCR反应的模板。本实验的 DNA 提取方法,步骤简单、用时缩短、简化了提取液的配置。因此,大大提高了利用 PCR 技术检测转基因植株的实际应用,可在转基因棉花的品种鉴定和纯度检测中大量应用。3. PCR 技术检测转基因抗虫棉 对用于转基因抗虫棉检测的 PCR 扩增程序进行了改进,使扩增时间缩短,特异性增强,建立了适用于 DNA 粗提液的相应 PCR 反应体系。具体如下:循环参数为 94℃预变性 2min,94℃变性 40s,适当温度退火 40s, 72℃延伸 50s, 30 个循环,72℃ 延伸 5min。反应体系:2.5μl 10×Buffer, 1.5μl Mg~(2+) (25mM), lμl dNTP(2.5mM), 0.2μl TaqE(5U), 0.5μl Primer(20pmo1/μl),lμl DNA 约 60ng, H20 17.8μl,共 25μl。用建立的 PCR 技术对转基因抗虫棉样品中棉所 41 和国抗一号进行了检测。检测结果两样品中转基因抗虫棉所占比例分别是 94%和 92%,证明所建立的检测体系是有效的。……   
[关键词]:转 Bt 基因棉;DNA;PCR;RAPD;SSR
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:安徽农业大学2005年