手机知网 App
24小时专家级知识服务
打 开
手机知网|搜索

抗恩诺沙星单克隆抗体的研制及初步应用

李海

  恩诺沙星(enrofloxacin, ENR)是动物专用的氟喹诺酮类药物,广泛用于动物疾病的治疗和预防。近年来其在动物组织中的残留危害,引起广泛关注。美国等国家已经禁止恩诺沙星用于动物生产,欧盟规定在可食性动物组织中恩诺沙星的最高残留限量(MRL)为30ug/kg。本研究旨在通过试验,制备抗ENR单克隆抗体,建立ENR残留的免疫学检测方法,为试剂盒的开发应用奠定基础,试验结果如下:1.采用N-羟基琥珀酰亚胺活性酯法合成了两种人工抗原ENR-BSA、ENR-OVA,用Feel_3显色、紫外扫描对人工抗原进行确认。结果表明:透析外液与Fecl_3显浅黄色,透析内液与Fecl_3呈红色且略显混浊,说明透析内液仍存在高浓度的恩诺沙星,初步确认ENR与BSA、OVA的交联成功;紫外扫描图谱显示ENR-BSA和ENR-OVA分别在319nm和320nm波长处有最大吸收峰,此外还分别在332nm波长处有ENR特征峰,进一步说明半抗原ENR已分别与载体BSA和OVA交联成功。2.以ENR-BSA为免疫抗原,免疫8周龄BALB/C系小鼠,经过三次免疫后,将小鼠断尾采血,以ENR-OVA为包被抗原,用间接EIISA法选出血清具有抗ENR的阳性鼠,取阳性小鼠的脾细胞与SP2/0细胞用50%PEG1500进行融合。通过检测、克隆、筛选等步骤,最终筛选出两株产抗ENR单抗的细胞株B_5和G_(12)。取B_5和G_(12)细胞上清液进行单抗亚型鉴定,表明两株细胞所产单抗均为IgG2b型抗体。将两株杂交瘤细胞分别注射小鼠产生腹水,并对腹水用辛酸-硫酸胺法纯化,SDS-PAGE电泳结果为两条清晰的条带,一条为重链,一条为轻链。3.用方阵滴定法确定了抗原最佳包被浓度(6.25 ug/mL)、G_(12)株细胞所产单抗纯化后的工作浓度(1:8000)及间接ELISA最佳反应条件,以此建立了ENR残留的ELISA检测方法;绘制了ENR对G_(12)细胞株所产单克隆抗体的抑制曲线,标准曲线在0.3-10000 ng/mL之间线形关系良好(R~2=0.9805),检测限(LOD)为0.3ng/mL,IC_(50)为24.5 ng/mL;ENR单克隆抗体与环丙沙星、氧氟沙星、庆大霉素、青霉素钾、磺胺嘧啶、四环素六种药物的交叉反应性均小于0.51%。结果表明,试验建立的ENR残留检测的ELISA方法灵敏度高、特异性好。用甲醇-PBS液将ENR稀释成不同浓度并分别加入鸡组织空白样品中,测定ENR的添加回收率。试验表明,鸡肌肉、肝脏、肾脏中各浓度组ENR添加平均回收率为81.3-91.2%,变异系数为3.2-17.8%,除低浓度组外,回收率结果较为一致。实验肉仔鸡连续4天口服ENR(10mg/kg),休药期第2、6、10、14天对鸡组织中ENR的残留进行检测。研究表明,休药期第6天,肌肉、肝脏和肾脏的残留量分别为8.2、26.9、21.8 ng/g,低于欧盟规定的ENR最高残留限量。……   
[关键词]:恩诺沙星;人工抗原;单克隆抗体;ELISA
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:西南农业大学2005年