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氯霉素酶联免疫分析方法及试剂盒研究

黄雅丽

  本研究从氯霉素分子结构中的二氯酰胺醇的-OH基团位点出发,通过琥珀酸酐法合成了两种半抗原:琥珀氯霉素单酯(CAP-HS_1)和琥珀氯霉素双酯(CAP-HS_2),纯化后分别与BSA偶联作免疫原,分别测得结合比为11.12:1和3.01:1,经免疫兔子得到两种抗氯霉素多克隆抗体:抗CAP-HS_1抗体(Ab_1)和抗CAP-HS_2抗体(Ab_2),相应冻干粉的效价分别为8.39×10~6和6.55×10~4。通过比较不同的抗体-酶标记方法,选用改良过碘酸钠法标记两种多克隆抗体。对固相载体、包被缓冲液、包被温度、时间、溶剂、减少非特异性吸附的方法等因素的筛选试验比较,优化了酶联免疫分析的方法和条件。结果表明,用丹麦产酶标板NUNC Immuno plate,pH9.6 0.05M CBS稀释包被抗原,在37℃下包被2h效果最佳,在抗原抗体反应过程中加入2%牛奶、10%小牛血清、0.1%BSA、1%明胶溶液等可减少非特异性吸附,提高检测灵敏度,其中又以2%牛奶稀释液和10%小牛血清溶液为好。采用优化后的分析条件和酶标抗体,用直接竞争ELISA方法进行了抗体亲和力和特异性研究。结果表明,抗CAP-HS_1抗体对氯霉素有较高的亲和力,其效价优于抗CAP-HS_2抗体,氯霉素在0.3125-160ng/mL浓度范围内,对CAP-HS_1及其抗体的反应抑制率与浓度呈线性关系,线性回归方程为y=10.94Ln(x)+30.394,r=0.999,抑制中浓度IC_(50)=6.002ng/mL,最低检测限IC_(20)=0.386ng/mL。抗CAP-HS_1抗体对氯霉素有很高的特异性,对各类似物如甲砜霉素、氟甲砜霉素的交叉反应率分别为0.025%和0.166%,对本研究中用到的其他类抗生素的交叉反应率低于2×10~(-5),与文献报道基本相符。用抗CAP-HS_1抗体初步研制了氯霉素残留检测用直接竞争ELISA试剂盒,分别对虾仁、猪肉、鸡肉和鸡蛋样品进行检测方法试验,样品的添加回收率范围在71.6~117.8%,试剂盒的重现性好,变异系数小于13.9%,可满足样品中氯霉素残留量的检测,为开发具有自主知识产权的氯霉素试剂盒打下了良好的基础。……   
[关键词]:氯霉素;多克隆抗体;酶联免疫吸附分析;试剂盒
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:浙江大学2005年