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犬科动物中犬冠状病毒的检测、分离及其S、M基因分析

马光刚

  用套式PCR(RT-nPCR)方法对采自某养殖场健康狐狸(61份)、貉(24份)粪样进行犬冠状病毒(CCV)检测并进行基因型鉴定。结果显示:健康狐狸、貉中存在很高比例的CCV感染,并且是CCV Ⅰ、Ⅱ型并存。序列及系统进化分析表明,CCV Ⅰ型与源于意大利腹泻犬的CCV Ⅰ型(AF502583)同源性最高(96.7%-98.1%);CCV Ⅰ、Ⅱ两种基因型同源性为88.3%-89.7%,在进化树中处于两个大的分支上;同为CCV Ⅱ型,狐狸源与貉源序列也存在多个位点差异。本试验首次在貉粪中检出CCV。从已检测为CCV阳性的健康犬、狐狸、貉粪样及病死狐狸肝脏中分离到4株CCV,经基因型鉴定都为CCV Ⅱ型,未分离到Ⅰ型。4株分离毒的细胞病变明显不同于参考毒。应用参考毒CCV-1-71的3株中和单抗和多抗对分离毒进行了中和试验、间接免疫荧光、SDS-PAGE和Western-blot分析,发现两者在S蛋白抗原性特别是中和表位上差异很大,但在M蛋白和N蛋白上则有抗原性交叉。对分离的4株CCV进行了全长M基因的克隆,进行了序列分析和蛋白结构的预测。结果表明,虽然来源不同,但4株分离毒之间以及与参考毒CCV-1-71 M基因都有很高的同源性,抗原性位点分布基本一致。与国内的CCV分离株V1、V2和DXMV同源性也很高,但与另一株国内分离株CCV-NJ17同源性较低,说明国内CCV在进化上很可能存在共同的来源,但也可能存在变异株或独立进化的毒株。所有CCV毒株在对应FCoV Ⅱ型毒株79-1683可能的同源重组“热点”区内都有一个“CTTTAG”序列,在M蛋白第16、17位或17、18位氨基酸之间有信号肽的剪切位点。包括4株分离毒在内的大部分CCV M蛋白在结构上相似,均有3个螺旋跨膜区,N末端位于膜外,C末端位于膜内,两个膜外区,两个膜内区。近C端的氨基酸无明显的亲水或疏水区域克隆了CCV-HF3和CCV-DF的S基因5’端1470bp序列,通过与参考毒CCV-1-71的比较发现,虽然HF3和DF的来源不同,但两株CCV之间及其与参考毒的同源性很高,仅有个别氨基酸位点存在差异,在进化树中处于同一分支上,抗原性预测结果也基本一致。HF3的信号肽剪切位点与DF和1-71不同,在靠近信号肽的区域内抗原性有差异;预测的DF的N-联糖基化位点比HF3和1-71少一个,以上不同可能都由点突变引起。HF3和DF与参考毒1-71在S蛋白的抗原性之所以差异,推测可能是由S基因个别碱基的突变引起。……   
[关键词]:犬冠状病毒;CCV I型;CCV II型;膜蛋白;纤突蛋白
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:南京农业大学2005年