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鸡干扰素与干扰素受体重组蛋白的生物学特性及其相互作用

韩春来

  干扰素是一种具有抗病毒、抑制细胞增殖和免疫调节活性的细胞因子,干扰素与干扰素受体结合后启动信号传导和干扰素基因的转录。本文克隆并表达了惠阳胡须鸡IFN-α、IFN-β、IFNAR1、IFNAR2基因;首次克隆了鸡IFNGR2全长cDNA;分析了干扰素受体在外周血淋巴细胞和各器官组织中的分布;并对IFN-α、IFN-β与其受体在体外的相互作用和重组蛋白的二级结构进行了研究。以肝脏DNA为模板,克隆了惠刚胡须鸡IFN-α基因,与Genbank上IFN-α的同源性为96.9%~97.9%,是一个新的亚型;克隆了惠阳胡须鸡IFN-β和AA肉鸡IFN-β基因,与白色来亨鸡IFN-β的核苷酸序列同源性分别为99.84%、100%,目前鸡IFN-β尚未发现亚型的存在。构建了鸡IFN-α/pGEX-6P-1和IFN-β/pGEX-6P-1重组质粒,在BL21中诱导表达,可溶性蛋白通过亲和层析得到纯化并采用Western-blot得到了鉴定。IFN-α、IFN-β重组蛋白具有较高的生物学活性,在CEF/VSV系统中的抗病毒活性为7.9×10~5U/mg和6.4×10~4U/mg。从惠阳胡须鸡肝脏总RNA中扩增了Ⅰ型干扰素受体的两个亚基:IFNAR1、IFNAR2。惠阳胡须鸡IFNAR1、IFNAR2分别与红色原鸡的IFNAR1、IFNAR2的氨基酸序列同源性为99.47%和98.82%,均为新的亚型。在IFNAR1氨基酸序列的35-133、134-237、240-319和341-447处有四个典型的干扰素受体家族的保守性motif:Fibronectin Ⅲ型分子,123-129和302-321处有两个典型的linker;在IFNAR2氨基酸序列的37-93处和129-240处有两个Fibronectin Ⅲ型分子,在94-105和157-166处有两个典型的linker。构建了鸡IFNAR1EC/pGEX-6P-1、IFNAR2EC/pGEX-6P-1重组质粒并转化到BL21中诱导表达,可溶性蛋白通过亲和层析得到纯化并采用Western-blot得到了鉴定。以惠阳胡须鸡脾脏总RNA为模板,采用5′RACE和3′RACE的方法首次克隆了IFN-γ受体β链全长cDNA序列,共2221bp。这一基因编码334个氨基酸,与小鼠、大鼠和人IFNGR2氨基酸的同源性分别为29%、28%和30%;在氨基酸序列的31-119和126-217处含有两个Fibronectin Ⅲ型分子,在96-115和115-131处有两个linker。将采用RACE克隆的这一基因命名为惠阳胡须鸡IFNGR2(HuiYang chicken IFNGR2)。Genome BLAST的结果显示IFNGR2与IFNAR1、IFNAR2、IL-10R2串联排列于鸡的1号染色体上。采用Northern杂交和RT-PCR的方法,分析了鸡IFN-α、IFN-β、IFNAR1EC、IFNAR2EC和IFNGR2EC基因在脾脏、胸腺、法式囊、胸肌、心肌、肾脏、肝脏、盲肠扁桃体、未刺激外周血淋巴细胞(PBL)和ConA刺激PBL中的表达水平。IFN-α、IFN-β基因在组织和未刺激的PBL中呈关闭状态,在ConA刺激的PBL中表达水平很高。未刺激的PBL中IFNAR1、IFNGR2的表达水平很高,IFNAR2的表达水平较低,ConA刺激后IFNAR1、IFNAR2和IFNGR2的表达水平没有明显上升。在脾脏、胸腺、法氏囊和盲肠扁桃体中均可检测到IFNAR1、IFNAR2和IFNGR2的表达;IFNGR2在胸肌、心肌、肝脏和肾脏中表达水平也较高。RT-PCR的结果与Northern杂交的结果基本一致。鸡IFNAR1、IFNAR2和IFNGR2在免疫器官中的表达量较高,表明其参与机体的抗病毒和免疫调节过程。……   
[关键词]:惠阳胡须鸡;干扰素;干扰素受体;原核表达;圆二色;蛋白相互作用
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国农业大学2005年